بخشی از مقاله
چکیده:
در این پژوهش، کاربرد روش میکرواستخراج مایع مایع پخشی فاز معکوس بدون استفاده از حلال آلی برای پیش تغلیظ و تعیین مقدار ویتامین E در نمونه های مختلف روغن گیاهی توسعه داده شد. روش میکرواستخراج براساس انتقال آنالیت از ماتریس روغن به یک فاز آبی غنی از سورفکتانت است و به همین دلیل حلال استخراج آلی در این روش استفاده نشده است.
متغیرهای مورد نظر در این روش با استفاده از روش های کمومتریکس بهینه سازی شدند. ابتدا در آزمایشات غربالگری، روش طراحی فاکتوریل کامل برای انتخاب متغیرهای موثر بر روش استخراج ارائه شده استفاده شدند. سپس متغیرهای انتخاب شده با استفاده از روش سطح پاسخ براساس طراحی مرکب مرکزی همراه با تابع مطلوبیت بهینه سازی شدند. در شرایط بهینه گستره خطی دینامیکی 0/008-2/0 میکروگرم بر میلی لیتر برای ویتامین E به دست آمد. بر اساس نتایج به دست آمده، فاکتور پیشتغلیظ برای ویتامین E به ترتیب 138 با درصد بازیابی %91 بدست آمد.
مقدمه
ویتامینها ترکیبات آلی هستند که قسمتهای مختلف بدن به مقدار محدود به آنها نیاز دارند .[1] در واقع یک ترکیب شیمیایی آلی هنگامی ویتامین نامیده می شود که ارگانهای بدن نتوانند آن را در مقادیر کافی سنتز کنند و بنابراین باید از رژیم غذایی دریافت شوند. ویتامینها به دو دسته ویتامینهای محلول در آب و محلول در چربی طبقه بندی می شوند.
در بدن انسان، 13 نوع ویتامین وجود دارد که شامل 4 ویتامین محلول در چربی - K, E, D,A - و 9 ویتامین محلول در آب 8 - ویتامین گروه B و ویتامین - C است. آلفا توکوفرول شکل کلی ویتامین Eدر بافت و خون انسان است . این نوع از ویتامین Eبالاترین فعالیتبیولوژیکی را در میان توکوفرولها و توکوتری انولها نشان میدهد
ادعاهایی در مورد فعالیت پیشگیرانه توکوفرول در مقابل گونه های اکسیژن فعال - ROS - در سیستم های بیولوژیکی وجود دارد که اثر مثبت روی برخی از انواع سرطان، حفظ سیستم ایمنی و بیماری های قلبی و عروقی دارد. مصرف بیش از 1000 میلی گرم از ویتامین E در روز ممکن است سبب بیماریهای ناشی از ازدیاد ویتامین در بدن شود
در روش میکرواستخراج مایع مایع پخشی معکوس، قطبیت حلال در مقایسه با روش میکرواستخراج مایع مایع پخشی نرمال معکوس گردیده و آب، جایگزین حلال های آلی هالوژن دار سمی می گردد 5]و .[4 مزیت این روش زمان آنالیز کوتاه و عدم استفاده از حلال های کلردار سمی می باشد.[5] بنابراین با توجه به اهمیت ویتامینهای محلول بر چربی و نقش آن بر سلامتی انسان، روشی ساده و گزینشپذیر برای اندازهگیری مقادیر کم ویتامین E ارائه شد.
بخش تجربی
1-2 مواد شیمیایی و محلولهای مورد استفاده
0/02 گرم از آلفا توکوفرول - ویتامین - E تهیه شده از شرکت سیگما در -nبوتانول حل شده و به حجم 10/0 میلیلیتر رساند شد و بدین صورت محلول مادر ویتامین E با غلظت 2000/0 میلی-گرم بر لیتر تهیه شد. محلولهای رقیق تر بوسیله رقیق سازی روزانه بامخلوط آب-اتانول - 80-20 - آماده سازی گردید. محلول 0/16 مول بر لیتر سورفکتانت Brij-35 در بالن 100/0 میلی لیتری تهیه گردید. مخلوط متانول - آب با نسبت حجمی 10-90 و سرعت جریان 1/0 میلی لیتر بر دقیقه به عنوان فاز متحرک انتخاب گردید .[9] بقیه مواد شیمیایی با گرید تجزیهای از شرکت مرک - آلمان - تهیه گردید.
2-2 سیستم دستگاهی مورد استفاده
اندازهگیری ویتامینE در این پروژه با استفاده از سیستم کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا مدل Agilent 1100مجهز به آشکارساز فرا بنفش چند طول موجی - MWD-UV - انجام شد. همچنین یک رایانه مجهز به برنامه نرم افزاری Agilent ChemStationبرای پردازش دادههای کروماتوگرافی مورد استفاده قرار گرفت. ستون مورد استفاده نیز از نوع × 4/5 - C18 150 میلی متر با اندازه ذرات 5 میکرومتر - بود. حمام آب فرا صوت - BANDELIN الکترونیکی، DT510H، آلمان - و یک دستگاه سانتریفیوژ - Hettich EBA 20 ، آلمان - در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفت. تنظیم و اندازهگیری pH محلول نمونه و فاز متحرک با استفاده از دستگاه pH متر ساخت شرکت متراهم مدل 780 مجهز به الکترود ترکیبی شیشهای-کالومل 3/0 - مولار پتاسیم کلرید - انجام شد.
3-2 روش میکرواستخراج فاز مایع
4/0 میلی لیتر روغن خوراکی با 1/0 میلی لیتر سیکلوهگزان به عنوان رقیق کننده در یک لوله آزمایش یکنواخت گردید. فاز استخراج کننده که شامل محلول سورفکتانت - محلول - Brij-35 میباشد، به سرعت به درون لوله آزمایش تزریق گردید. محلول تشکیل شده به مدت 15 دقیقه در حمام فراصوت قرار گرفت تا محلول استخراج کننده به درون محلول روغن پخش شود. پس از سانترفیوژ نمونه با سرعت 3500 دور بر دقیقه به مدت 10 دقیقه، 5/0 میکرولیتر از حلال ته نشین شده به دستگاه HPLC تزریق و مورد آنالیز قرار گرفت.
نتایج و بحث
1-3 طراحی فاکتوریل کامل به عنوان مرحله غربالگری
با استفاده از نتایج حاصل از روش بهینهسازی یک متغیر در یک زمان، سطوح بالا و پایین هریک از فاکتورها مشخص گردید. سطوح انتخاب شده برای فاکتورها در جدول 1 آورده شده است.
جدول : - 1 - تعیین سطح فاکتورهای موثر بر پیشتغلیظ و اندازهگیری ویتامین E
جدول : - 2 - جدول ضرایب حاصل از طرح فاکتوریل کامل
برای طراحی آزمایشها به منظور تعیین فاکتورهای مهم بر پیش-تغلیظ و اندازهگیری ویتامین E، از طراحی فاکتوریل کامل استفاده گردید و برای پردازش داده ها نیز از نرمافزار Statgraphic 05 استفاده شد. تعداد آزمایشها در طرح فاکتوریل کامل هنگامی که 4 فاکتور مورد بررسی باشد، 16 آزمایش خواهد بود.
در ادامه نتایج بدست آمده مورد تحلیل قرار گرفته و فاکتورهای موثر به ترتیب اهمیت مشخص میشوند که نتایج مربوط به ضرایب حاصل از طراحی فاکتوریل در جدول 2 نشان داده شده است. شکل 1 نمودار پارتو حاصل از طراحی فاکتوریل کامل را نشان می دهد. نمودار پارتو نشان می دهد که فاکتورهای حجم و غلظت سورفکتانت و همچنین برهمکنش بین حجم سورفکتانت و زمان استخراج دارای پارامتر P کمتر 0/05 و جز فاکتورهای موثر بر پیش تغلیظ و اندازهگیری ویتامین E می باشد.
2-3× طراحی مرکب مرکزی
در این طراحی، تعداد آزمایشها هنگامی که 2 فاکتور با 3 نقطه مرکزی وجود دارد، برابر با 11 آزمایش میباشد.
نتایج تجربی حاصل از انجام آزمایشهای طراحی شده، به وسیله روش ANOVA مورد تجزیه و بررسی قرار گرفتند. براساس نتایج به دست آمده، غلظت و حجم سورفکتانت از فاکتورهای مهم و دارای اثر مثبت بر رویهی پاسخ می باشد. بنابراین با کاهش غلظت Brij-35 و همچنین کاهش حجم محلول سورفکتانت بازده استخراج افزایش می یابد. غلظت سورفاکتانت از این نظر مهم است که میتواند امولسیون و فرایند انتقال جرم را تحت تاثیر قرار دهد. با انتخاب غلظتهای پایین Brij-35، بازده استخراج افزایش یافت. با توجه به نتایج بهدست آمده، در غلظت-های بالاتر، تقریبا جدایی فاز پس از سانتریفیوژ اتفاق نمیافتد زیرا با افزایش غلظت سورفاکتانت کشش سطحی بین دو فاز، کاهش یافته و باعث افزایش حلالیت قطره استخراج در محلول نمونه و کاهش بازده استخراج میشود.
