بخشی از مقاله
چکیده
گیاه پونه یکی از منابع مهم به منظور دستیابی به اهداف دارویی است. در این مطالعه، تنوع ژنتیکی 11 اکوتیپ گیاه پونه Mentha longifolia با استفاده از 15 نشانگر مولکولی RAPD بررسی شده است. 15 آغازگر RAPD در مجموع 167 باند تکثیر کردند که 163 باند - 97/29 - چند شکلی و 4 باند - 2/71 - تک شکلی بودند. محتوای اطلاعات چند شکلی - PIC - در محدودهی 0/149 - آغازگر - 83 تا 0/256 - آغازگر - 3 بود. اکوتیپ شماره 1 با اکوتیپ شماره 2 بیشترین شباهت ژنتیکی 0/952 و کمترین فاصله ژنتیکی 0/049 را دارا بود.
حداقل تشابه ژنتیکی 0/839 بود که بین اکوتیپهای شماره 5 با 11 مشاهده شد. تجزیه و تحلیل خوشهای ژنوتیپها با استفاده از ضریب تشابه جاکارد و به روش UPGMA انجام شد. 11 اکوتیپ گیاه پونه در 4 گروه دستهبندی شدند. گروه اول شامل اکوتیپهای شماره 1، 2و3 بود، گروه دوم شامل اکوتیپ شماره 4، گروه سوم شامل اکوتیپهای 5، 6 و 7 و گروه چهارم شامل اکوتیپهای 8، 9، 10 و 11 بود. دادههای حاصل از تجزیه به مولفههای اصلی نتایج گروهبندی را تایید کرد. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که نشانگر RAPD میتواند به طور موثری برای تعیین تنوع ژنتیکی اکوتیپهای گیاه پونه بکار میرود.
مقدمه و هدف
خانواده نعناعیان یکی از بزرگترین خانوادههای گیاهی است که دارای پراکنش جهانی میباشد و در حدود 200 جنس و بین 2 تا 5 هزار گونه از بوتههای معطر و درختچهای کوتاه دارد. این خانواده دارای تنوع گستردهای بوده، در ایران شش گونه از جنس نعناع M. mozaffarianii - ، M. aquatica، M. arvensis، M. longifolia، M. spicata، M. - suaveolens گزارش شده است
Mentha longifolia یکی از شش گونهای است که در ایران وجود دارد و مورد توجه رار گرفته است. به دلیل اهمیت دارویی، غذایی و بهداشتی پونه امروزه کمتر کسی است که با این گیاه سروکار نداشته باشد، زیرا انواع خواص درمانی اسانسها نسبت به بیماریهای میکروبی [6]، غیر میکروبی [11]، اثر کشندگی با بازدارندگی روی باکتریها و مخمرها [10] و نیز تاثیر ضد قارچی آنها کاملا مشخص شده است. از کلیه قسمتهای گیاه بوی قوی استشمام میگردد، ولی این بو در پایههائی که در آب زندگی میکنند اصولاً وجود ندارد. گلهای آن به صورت دستههای فراهم در کناره برگهای طول محور ساقه در ماههای تیر تا مهر ظاهر میشود. رنگ گلی روشن یا مایل به بنفش دارد.
میوه هاش 4 فندقه و صاف است. اعضاء مختلف این گیاه دارای تانن، مواد رزینی، مواد پکتیکی، قند و اسانس است. دارای 75-90 درصد از ترکیبات ستن دارمخصوصاً پوله ژون، الکلهای توتال به مقدار 7 -12، لیمونن و دیپانتن است. اسانس مذکور به اسانس پونه یا روغن پنی رویال - Penny royal oil - مرسوم است. و گاهی نیز با درخشندگی آبی رنگ جلوه میکند که علت آن وجود مادهای به نام آزولن در آن است. در برگ گیاه مذکور، وجود هسپریدین یا دیوسمین مشخص گردیده که مشابه ماده موجود در مرکبات است.
اسانس پونه بر حسب آنکه از تقطیر اعضاء چه نوع گیاهی بدست آمده باشد مشخصاتنسبتاً متفاوتی نشان میدهد. گونههای خانواده نعناعیان همانند آویشن و پونه به علت دارا بودن مقادیر بالای مونوترپنها، تیمول و کارواکرول خاصیت آنتیاکسیدانی از خود نشان میدهند
تکنیک RAPD مبتنی بر واکنش PCR بوده و در آن آغازگرهای 10 نوکلئوتیدی با ردیف بازی تصادفی مورد استفاده قرار میگیرند. در این تکنیک یک آغازگر منفرد، به نقاط مکمل خود در رشته DNA در محدوده قابل تکثیر توسط PCR باشد، ردیف بازی بین دو نقطه اتصال، تکثیر خواهد شد. در واقع انگشتنگاری RAPD بررسی قطعات DNA تولید شده توسط PCR است. در مطالعهای پتانسیل تجزیه و تحلیل به وسیله نشانگرهای RAPD و ISSR برای مقاصد انگشتنگاری مورد بررسی قرار کرفت. این آزمایش نشان داد تجزیه و تحلیل به وسیله نشانگرهای RAPD و ISSR یک سیستم سریع، قابل اعتماد و بسیار آمرزنده برای انگشتنگاری DNA و همچنین بررسی روابط ژنتیکی است
روابط ژنتیکی 16 نمونه جمعیت متعلق به سه گونه M.piperata، M.longifolia و M.spicata با استفاده از نشانگر جدید و ترکیبی R-ISSR مورد بررسی قرار گرفت. 12 ترکیب نشانگری 155 نوار را تکثیر نمودند که 146 نوار آن چند شکل بودند. نتایج این پژوهش نشان داد که خصوصیات ژنتیکی کمتری از گونه M.spicata در گونه M.piperata به ارث رسیده است. شباهت بالای دو گونه را میتوان به هیبریداسیون طبیعی در طی تکامل جنس نعناع مرتبط دانست
کارایی RAPD در تنوع ژنتیکی بین 13 نمونه آویشن - Thymus - مورد مطالعه قرار گرفت. به این منظور واکنش زنجیرهای پلیمراز - PCR - با استفاده از 9 نشانگر RAPD بر روی DNA ژنومی مورد مطالعه انجام گردید و 149 نوار باندی تولید نمود که 124 باند - %83/22 - چند شکلی نشان دادند. نتایج این مطالعه وجود تنوع ژنتیکی بالایی را در بین نمونههای مورد بررسی نشان داد. بنابرین به نظر میرسد این نشانگر مولکولی، ابزار مفیدی در بررسی روابط خویشاوندی و فاصله ژنتیکی نمونههای مختلف آویشن است.
نشانگرهای مولکولی وسیلهای قدرتمند برای تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی و روابط ژنتیکی هستند. هدف از انجام این تحقیق تجزیه و تحلیل نمونههای جمعآوری شده از مناطق مختلف کشور و بررسی تنوع ژنتیکی Mentha longifolia L. توسط نشانگر مولکولی RAPD و دستهبندی تودههای پونه به منظور برنامههای اصلاحی است.
مواد و روشها
به منظور آنالیز DNA به کمک نشانگر RAPD، بذور 11 اکوتیپ گیاه پونه از مناطق مختلف کشور، از موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع تهیه شده و در پتری دیش کاشته شد - جدول . - 1 بذور برای جوانهزنی در دستگاه ژرمیناتور با دما و رطوبت مناسب قرار داده شد پس از جوانهزنی بذور به گلدانهای کاغذی منتقل شد و در اتاقک رشد قرار داده شد،پس از اینکه گیاهچهها چند برگی شدند به گلدان منتقل و در شرایط گلخانه قرار گرفتند.
استخراج DNA از برگهای جوان بوسیله روش CTAB تغییر یافته مطابق با روش سقایی معروف صورت گرفت، حدود 0/3 - 0/5 گرم از برگهای تازه پونه در نیتروزن مایع پودر و با 8 میلیلیتر بافر پیش حرارت داده شده - 2 CTAB - 650C درصد و 0/9 گرم PVPP مخلوط شد. به هر نمونه 80 میکرو لیتر مرکاپتو اتانول اضافه گردید. سپس به مدت 60 دقیقه در بنماری با دمای 65 درجه سانتیگراد قرار گرفت. 4 میلیلیتر از کلروفرم/ ایزوامیل الکل - 1:24 - به تیوپ اضافه و 30 دقیقه ورتکس شد، سپس 20 دقیقه در 3000 دور سانتریفوژ شد.
مایع رویی را در میکروتیوپ 15 میلیلیتری قرار داده و 6 میلیلیتر ایزوپروپانول سرد اضافه کردیم و آن را به آهستگی تکان دادیم تا کلاف DNA ظاهر شد، پس از آن به مدت 20 دقیقه در 5000 دور سانتریفوژ شد. سپس رسوب باقیمانده با محلول شستشو، شستشو گردید و به مدت یک شب در محیط آزمایشگاه قرار گرفت تا کاملا خشک شد و 300 میکرولیتر محلول TE به رسوب اضافه شد و در فریزر - -20 0C - قرار گرفت. مقدار DNA وکمیت DNA با استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومتر و ژل آگارز %1 بررسی شد.
دستگاه اسپکتروفوتومتر غلظت DNA و نسبت جذب - A260/A280 - نمونه خالص DNA را اندازهگیری میکند. نشانگرهای مورد استفاده در این آزمایش توسط شرکت Mete bion آلمان ساخته شد ]جدول .[1 واکنش PCR با نشانگر RAPD با حجم 15 میکرولیتر انجام شد.
واکنش تکثیر قطعات DNA شامل 2 میکرو لیتر DNA ژنومی، 0/396 میکرولیتر نشانگر ، 7/5 میکرولیتر مستر میکس و 5/104 میکرو لیتر آب دی یونیزه است. تکثیر در ترموسایکلر انجام شد که شامل یک مرحله واسرشتسازی اولیه به مدت 5 دقیقه در 94 درجه سانتیگراد سپس مرحله دوم شامل 40 چرخه، که هر کدام شامل یک مرحله واسرشتسازی به مدت 1 دقیقه در دمای94 درجه سانتیگراد، یک مرحله اتصال آغازگرها به رشتههای الگو به مدت 1 دقیقه در دمای مناسب برای هر آغازگر و یک مرحله بسط رشته DNA توسط پلیمراز به مدت 1 دقیقه در 72 درجه سانتیگراد است، سپس مرحله بسط نهایی به مدت 5 دقیقه در 72 درجه سانتیگراد انجام شد. پس از مرحله نهایی نمونهها تا دمای 4 درجه سانتیگراد سرد شده و در این دما نچهداری شدند. محصول PCR در ژل آگارز %2 الکتروفورز شد . برای رویت و عکسبرداری از ژل با اشعه UV از دستگاه - UVTTEC cambrige - استفاده شد. تجزیه و تحلیل آماری دادهها با استفاده از نرمافزار NTSYS-PC 2.02 و Pop gen صورت گرفت.
