بخشی از مقاله
چکیده
در این مطالعه نمونههاي گیاهی از مزارع مختلف جمع آوري و ریزوباکترهاي آنها جداسازي شد.
خاصیت بازدارندگی این ایزولهها علیه Pectobacterium carotovorum، در شرایط درون شیشه مورد بررسی قرار گرفت و ایزولههایی با بی شترین خا صیت بازدارندگی انتخاب شدند. خا صیت بازدارندگی ایزولههاي منتخب در شرایط مزرعهاي نیز مورد بررسی قرار گرفت و مشخص شد که از بین ایزولههاي مورد استفاده تنها ایزوله 179
به صورت معنیدار و قابل توجهی باعث افزایش عملکرد سیب زمینی به اندازه سه برابر شاهد شد. بر ا ساس آزمونهاي بیوشیمیایی و مولکولی این ایزوله شناسایی شد.
مقدمه و هدف
گیاه سیبزمینی پس از چغندرقند داراي بیشترین مقدار انرژي و عملکرد ماده خشک در واحد سطح ا ست. چهارمین مح صول غذایی ا صلی در جهان پس از برنج - Oryza sativa L. - ، ذرت - Zea mays L. - و گندم - Triticum aestivum L. - محسوب میشود
باکتريهاي متعلق به جنسهاي Pectobacterium و Dickeya عوامل ایجاد ساق سیاه و پوسیدگی نرم غده سیب زمینی هستند که در تمام مناطق دنیا خسارت قابل توجهی به محصول سیب زمینی وارد میسازند .[17] این بیمارگرها از طریق منافذ و زخمها طبیعی - عدسکها، ناحیه رشد انتهایی ریشه و زخمهاي حشرات - و زخمهاي مکانیکی وارد گیاه میشوند
با وجود اهمیت زیاد این بیماري بر روي سیب زمینی و سایر محصولات، روش قابل قبولی براي کنترل این بیماري توسعه پیدا نکرده است و بیشتر روشهاي مورد استفاده جنبه پیش گیرانه دارند. هیچکدام از ارقام سیب زمینی مقاومت کامل ن سبت به این بیماري ندارند .[11] یکی از روشهاي موثري که براي کنترل این بیماري معرفی شده است، استفاده از ریزوباکترهاي مفید گیاهی جهت کنترل بیولوژیک این بیماري است
هدف از انجام این برر سی جدا سازي و غربال ریزوباکترهاي گرم مثبت از ریزو سفر گیاهان مختلف جهت یافتن ایزولههاي بازدارنده باکتري P. caratovorum بود. طی این بررسیهاي ایزولهاي با بازدارندگی قابل توجه بدست آمد و به عنوان Paenibacillus polymyxa شناسایی شد.
.2 تئوري و پیشینه تحقیق
باکتريهاي مختلفی از جنسهاي متنوعی همچون Pseudomonas، Bacillus، Serratia، Lactobacillus، و Lactococcus گزارش شدهاند که قادر به کنترل موفق ساق سیاه و پوسیدگی نرم سیب زمینی بودند 23]، 5، 14، 21، .[18 این باکتریهاي بیوکنترل، انواع مختلفی از متابولیتهاي ضد میکروبی نظیر سیانید هیدروژن، سیدروفورها و ترکیبات فرار تولید میکنند. در سالهاي اخیر گزارش شده است که بعضی از باکتريها و مولکولهایی با وزن مولکولی پایین قادر هستند که پیامهاي سیستم حد نصاب احساس N-acylhomoserin lacton را غیر فعال کرده و بیان فاکتورهاي بیماریزایی در Pectobacterium و Dicheya را تحت تاثیر قرار میدهند 4]، .[5 به این باکتريها که به اصطلاح خاموش کنندههاي حد نصاب - Quorum-quenching - میگویند.
.3 مواد و روشها
جداسازي باکتريهاي تولید کننده اندوسپور از ریزوسفر محصولات زراعی
براي جداسازي باکتريهاي تولید کننده اندوسپور، تقریبا تعداد 120 نمونه از ناحیه رایزوسفر گیاهان مختلف زراعی از مناطق مختلف ا ستان آذربایجان شرقی - مرند، ه شترود، کلیبر، ا سپیران، شب ستر - و آذربایجان غربی - ارومیه، نقده - به طور تصادفی جمعآوري شده و نمونهها به طور جداگانه در داخل کیسه فریزر به آزمای شگاه منتقل شدند.
جدا سازي باکتريها به روش چن و همکاران [2] صورت گرفت. ابتدا سه گرم از هر نمونه - ریشه گیاه یا خاك - در 27 میلیلیتر از محلول 85 درصد محلول نمک طعام استریل به اضافه Tween 80 به میزان 0/04 درصد مخلوط شدند و به مدت پنج دقیقه ورتکس شده و به حالت سوسپانسیون درآمد و سپس 10 دقیقه در دماي 80 درجه سانتیگراد در حمام بن ماري قرار گرفته شد تا باکتريهاي حساس به دماي بالا از بین رفته و تنها باکتريهاي تولید کننده اندوسپور باقی بمانند. از سوسپانسیون بدست سري رقت بدست آمد و 100 میکرولیتر از هر رقت در محیط کشت آگار غذایی - Nutirient Agar - کشت شد.
بررسی خاصیت آنتاگونیستی ریزوباکترهاي بدست آمده علیه P. carotovorum
بدین منظور از روش کاغذ صافی و از محیط ک شتهاي NB ا ستفاده شد. در این روش ابتدا جدایههاي آنتاگونی ست در محیط ک شت NB داخل ویالهاي ا ستریل ک شت داده شده و به مدت 18 ساعت در دماي 28 درجه سانتیگراد با 120 rpm قرار داده شدند. کاغذ صافیهاي استریل به قطر 5 میلیمتر به جدایههاي آنتاگونیست داخل ویالها با غلظت - 108cfu/ml - آغشته شده، سپس با استفاده از پنس استریل داخل تشتک پتري حاوي محیط ک شت NA قرار داده شدند و به مدت 24 ساعت در دماي 26 درجه سانتیگراد در انکوباتور قرار گرفتند.
از کشت 18 ساعته باکتري بیمارگر با غلظت - 108cfu/ml - داخل تشتکهاي پتري حاوي کاغذ صافیهاي آغشته به باکتري آنتاگونیست اسپري شده و به مدت 20-15 دقیقه زیر هود هوا خشک شدند سپس تشتکهاي پتري 48-24 ساعت در دماي 26 درجه سانتیگراد در انکوباتور نگهداري شدند و نواحی عدم رشد باکتري بیمارگر اندازهگیري شد. این آزمون نیز در قالب طرح کاملا تصادفی در سه تکرار براي هر جدایه باکتري در نظر گرفته شد
شناسایی بیوشیمیایی و مولکولی ایزوله منتخب
براي تشخیص نوع گرم باکتري از روشهاي رنگ آمیزي گرم و آزمون %3 KOH استفاده شد. آزمونهاي اکسیداز، کاتالاز، رشد هوازي و بیهوازي - OF - ، هیدرولیز نشاسته و هیدرولیز کازئین بر اساس روشهاي تشریح شده تو سط شاد و همکاران صورت گرفت .[20] براي شنا سایی مولکولی ژن rRNA تکثیر و توالی یابی شد.
استخراج DNA و انجام PCR بر اساس روشهاي استاندارد انجام شد .[25] براي تکثیر ژن از پرایمر هاي PS16f - TGGCTCAGATTGAACGCTGGCGG - و - GATCCAGCCGCAGGTTCCCCTAC - PS16r استفاده شد
. - Frapolli - محصول PCR بر روي ژل با نقطه ذوب پایین - LMP - لود شد و باند بدست آمده از ژل خالصسازي و توسط شرکت تکاپوزیست توالی یابی شد. نتایج بدست آمده توسط ابزار بلاست سرور NCBI مورد بررسی قرار گرفت.
بررسی اثر ایزولههاي منتخب در کنترل P. carotovorum در شرایط مزرعه
باکتري بیمارگر و باکتريهاي آنتاگونیست منتخب به روش شرح داده شده در بالا کشت شدند و بعد از حدود 16 ساعت باکتريهاي حاصل توسط سانتریوژ رسوب دهی شدند و یکبار با محلول 0/1 مولار MgSO4 شست و شو شدند. از رسوب باکتريهاي بدست آمده سوسپانسیونهایی با غلظت 108 سلول بر میلی لیتر تهیه شد و براي آزمایشات مورد استفاده قرار گرفت.
غده هاي سیب زمینی - رقم آگریا - با سوسپانسیون باکتري آنتاگونیست اسپريپاشی شدند و در قسمتی از مزرعه که خاك آن با باکتري بیمارگر آلوده سازي شده بود کشت شدند. سم مخلوط بردو به عنوان شاهد مثبت و آب مقطر استریل به عنوان شاهد منفی در تیمار غدهها مورد استفاده قرار گرفتند. گیاهان در شرایط مزرعه با رعایت فاصله کشت، با سه تکرار و در قالب طرح کاملاً تصادفی کشت و به مدت 4 ماه نگهداري شدند. در طول این مدت آبیاري گیاهان به میزان مورد نیاز صورت گرفت و در از هیچ کود شیمیایی استفاده نشد. پس از اتمام دوره رشد، بوته ها به آزمایشگاه منتقل شدند و غدههاي بدست آمده از آنها مورد بررسی قرار گرفت.
