بخشی از مقاله
چکیده
نتایج مطالعات ژنوم گیاهان مختلف تا سال 1998 مشخص کرد که حدود 50 درصد از ژنهایی که جدید شناسایی میشوند، داراي توالیهاي مشابه و آرایش حفاظت شده ژنومی در مقایسه با ژنهایی هستند که در گذشته شناخته شدهاند. این یافته اساس پیدایش ژنومیکس مقایسهاي - Comparative genomics - شد. در این راستا با بهره گیري از ریز تشابهات ژنومی - Micro-synteny - و همراستایی - Colinearity - مولکولی بین ژنوم توالی یابی نشده جو در مقایسه با ژنوم هاي توالی یابی شده خانواده پواسه - گرامینه - نظیر برنج، ذرت، سورگوم و براکی پودیوم ، مکان کروموزومی ژن فشردگی سنبله - dsp.ar - مورد مطالعه قرار گرفت.
ژن مزبور از جمله ژن هاي تکاملی و مرتبط با مورفولوژي سنبله و کنترل عملکرد در جو می باشد که از جنبه هاي اقتصادي حائز اهمیت است. با ابداع نشانگرهاي جدید STS ، SNP و EST و تبدیل آنها به نشانگرهاي مبتنی بر PCR به روش Cleaved Amplified Polymorphic Sequences - CAPS - و Pyrosequencing امکان اشباع نقشه پیوستگی مولکولی در ناحیه سانترومري کروموزوم 7H و مکان یابی ژن فشردگی سنبله - dsp.ar - فراهم گردید.
از نشانگرهاي پیوسته با ژن مذکور در فاصله اي کمتر از 1 سانتی مورگان جهت گزینش به کمک نشانگر - Marker Assisted Breeding - و همسانه سازي این ژن بر اساس نقشه - Map-based cloning - استفاده خواهد شد. روش استفاده شده در این تحقیق قابل تعمیم به سایر ژن ها و ژنوم هاي گیاهی جهت بهره گیري از آن در اصلاح نباتات مولکولی و بیوتکنولوژي کشاورزي است که به تفصیل به شرح آن پرداخته خواهد شد.
مقدمه
از نشانگرهاي مولکولی جهت تشخیص و تمایز گونههاي مختلف، بررسی تنوع ژنتیکی ژرم پلاسم گیاهی ، تأیید گردهافشانی و اثبات هویت دورگها، ارزیابی خلوص ژنتیکی لاینهاي اصلاحی، ارزیابی تنوع سوماکلونال، پیش بینی عملکرد و پتانسیل هتروزیس گیاهان دورگ، گزینش زودهنگام و غیرتخریبکننده و غربال ژرم پلاسم گیاهی از نظر صفات مفید استفاده میگردد.
با وجود این عمدهترین هدف از کاربرد نشانگرهاي مولکولی در بهگزینی به روش نشانگر - MAS - بوده است. گزینش به کمک نشانگر فرصت مناسبی براي بهبود کارایی انتخاب ژنوتیپهاي مطلوب از حیث صفت مورد نظر فراهم مینماید و راهکاري بالقوه براي سرعت بخشیدن و گزینش دقیق در اصلاح نباتات مولکولی و بیوتکنولوژي کشاورزي است. لازمه گزینش به کمک نشانگر تهیه نقشههاي پیوستگی نشانگرهاي مولکولی براي جمعیتهاي مختلف ژنتیکی است.
نقشه ژنومی، آمیزهاي از مفاهیم ژنتیک کلاسیک، روشهاي بیومتري و بیولوژي مولکولی است و ابزار قدرتمندي براي مطالعات ژنتیکی گیاهان میباشد. بر اساس نقشه هاي ژنتیکی و پیوستگی نشانگرها میتوان موقعیت مکانی ژنهاي کنترلکننده صفات موردنظر را تعیین کرد. تهیه نقشه و توالییابی ژنوم گیاهان کمکی بزرگ به درك عمل، تنظیم و بیان وهمسانه سازي ژنها نیز می باشد.
تکمیل نقشه ژنی و توالییابی ژنوم آرابیدوپسیس و برنج نشان داد که آرایش ژنها اغلب در میان گونههاي خویشاوند بهصورت محافظت شده - Conserved - میباشد.[3] بنابراین از ژنومیکس مقایسهاي میتوان خصوصاً از جنبههاي تکاملی در اصلاح نباتات مولکولی بهره برد، زیرا نتایج تحقیقات اخیر حاکی از تأثیر انتخاب طبیعی در طی تکامل بر نحوة تنظیم و بیان ژنها و نقش نواحی ترجمه شده ژنوم در وظیفه ژن و فرایندهاي متابولیت است.
نتایج مطالعه ژنوم غلات نشان میدهد که اگرچه حدود 50 میلیون سال پیش سه گونه گندم، برنج و جو از یکدیگر تمایز حاصل نمودهاند، بهجز در نواحی بین ژنی از توالیهاي حفاظت شده زیادي براي اکثر نواحی ژنومی برخوردارند. ژنومیکس مقایسهاي براي برنج، گندم، جو، ذرت و سورگوم نشاندهندة آرایش نشانگري محافظت شده براي نواحی بزرگ کروموزومی در این گونههاست و این اساس فرضیه تشابهات ژنومی در مطالعات نقشهیابی مقایسهاي میباشد
ژنوم جو به جز در نواحی اندکی از برگشتگیهاي کروموزومی، از هم راستایی بالایی با ژنومهاي A و D گندم برخوردار است. همچنین همراستایی بسیار مطلوبی نبی ژنوم جو و برنج خصوصاً در برخی از نواحی ژنومی گزارش شده است.[16] نتایج مجموعه مطالعات حاکی از وجود همراستایی در ترتیب آرایش ژنها روي این دو ژنوم است. بههمین علت دیوز و گیل[4] در سال 1998 ژنوم برنج را بهعنوان یک مدل مطلوب و منبعی براي یافتن نشانگر بهمنظور اشباع نقشه ژنوم جو مطرح نمودند. قابل ذکر است که اندازه ژنوم هاپلوئید جو - 2n = 2x =14 - حدود 4900Mb و اندازه ژنوم هاپلوئید برنج - 2n = 2x =24 - حدود 400Mb میباشد.
کاملترین نقشه ژنتیکی برنج متشکل از 12 گروه پیوستگی - لینکاژي - بهطول 1575 cM میباشد. این در حالی است که نقشه ژنتیکی جو از اندازهاي حدود 1245 cM روي 7 کروموزوم برخوردار است. همچنین ژنوم برنج حاوي میزان اندکی DNA تکرار شونده - 50% - در مقایسه با ژنوم جو - 80% - میباشد. اندازه کوچکتر و میزان کمتر توالیهاي تکرار شونده در ژنوم برنج نشاندهنده مزایاي استفاده از دستاورد پروژه توالییابی ژنوم برنج در برنامههاي همسانه سازي بر اساس نقشه خصوصاً همسانهسازي ژنها در ژنومهاي بزرگی نظیر جو و سایر غلات است
همچنین با توجه به اینکه این برنامهها مستلزم وجود نقشههاي هرچه اشباعتر براي نشانگرهاي مولکولی میباشند، از اطلاعات مذکور میتوان در تکمیل نقشههاي ژنتیکی ژنوم توالی یابی نشده جو بهره فراوان برد10] و .[15 این در حالی است که پس از تکمیل پروژه هاي توالی یابی سایر ژنوم هاي خانواده گرامینه نظیر ذرت، سورگوم و براکی پودیوم حتی درجه بالا تري از هم راستایی و ریز تشابهات ژنومی مشاهده شد و طیف وسیعتري از کاربرد ژنومیکس مقایسه اي براي تولید مخازن جدید و گسترده تر نشانگري مطرح گردید که از اهمیت فوق العاده اي در بیوتکنولوژي کشاورزي برخوردار است.
در هر سنبله جو سه سنبلچه وجود دارد و براساس شکل ظاهري سنبله به گروههاي دو ردیفه و شش ردیفه و حد واسط یا غیر شش ردیفه طبقهبندي میشود. ژن dsp.ar - موتانت ژن - dsp1 عامل فشردگی سنبله از طریق کوتاه سازي میان گره ها و به طبع آن کاهش طول سنبله و افزایش تراکم آرایش دانه در سنبله می باشد. مکان ژنی آن در ناحیه نا معلومی روي بازوي کوتاه کروموزوم 7H گزارش شده است
این ژن از جمله ژن هاي دخیل در فرایند تکاملی جو و کنترل کننده میزان عملکرد در این گیاه می باشد که خصوصا ازجنبه هاي اقتصادي حائز اهمیت است. لذا نقشه یابی این ژن به روشهاي مولکولی و ژنومیک از جمله ژنومیکس مقایسه اي براي ابداع نشانگر پیوسته و کاربرد آن در برنامه هاي گزینش به کمک نشانگر و همسانه سازي بر اساس نقشه در جهت اصلاح مولکولی جو ضروري است. به منظور نیل به این هدف مطالعه حاضر طراحی و اجرا گردید.
مواد و روشها
جمعیت گیاهی مورد استفاده براي مطالعه ژن dsp.ar شامل 3986 - 1993 گامت - نتاج F2 حاصل از تلاقی والد زراعی - Bowman - BO و ژنوتیپ موتانت BW265 - BW - بود. BO ژنوتیپی دو ردیفه با سنبله معمولی از لحاظ طول و فشردگی می باشد در حالیکه BW موتانت القاء شده به روش اشعه X براي فشردگی و کوتاهی سنبله است. ارزیابی فنوتیپی افراد نسل F2 و F3 در این جمعیت براي صفت فشردگی سنبله در شرایط کنترل شده گلخانه جهت حذف واریانس عوامل محیطی صورت گرفت.
استخراج DNA به روش CTAB و تغییر یافته اشتاین و همکاران [17] انجام شد. جهت گزینش نشانگرهاي اولیه از بانک نشانگرهاي ETS موجود در جو به نام HarvEST و اطلاعات حاصل از ژنومیکس مقایسه اي بین برنج، ذرت، سورگوم و براکی پودیوم براي همردیفی توالی هاي SSR ، SNP و STS گزارش شده توسط مایر و همکاران [12] استفاده گردید. توالی هاي ارتولوگ مورد استفاده از ژنوم هاي برنج، ذرت، سورگوم و براکی پودیوم جهت اشباع پیوستگی نشانگري مکان ژن dsp.ar از بانک هاي اطلاعاتی RAP-DB به آدرس: http://rapdb.dna.affrc.go.jp/tools/converter/runو MIPS به آدرس:
http://mips.helmholtz-muenchen.de/plant/brachypodium/searchjsp/blast.jspاستخراج گردید. همولوژي توالی هاي بدست آمده به روش آلتشول و همکاران [2] و استفاده از گزینه BLAST بانک اطلاعاتی NCBI به آدرس: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi انجام شد.
طراحی آغازگرها براي توالی هاي الگو با استفاده از نرم افزار Oligo5 صورت گرفت ودماي اتصال آغازگرها جهت بهینه سازي شرایط واکنش زنجیره اي پلیمراز - PCR - در نظر گرفته شد. پس از الکتروفورز، به منظور آشکارسازي نوارهاي تکثیر شده، ژلهاي الکتروفورزي بامحلول اتیدیوم بروماید رنگ آمیزي شدند.
در صورت عدم مشاهده چند شکلی طولی و بهمنظور شناسایی چندشکلی هاي تک نوکلئوتیدي - SNPs - لازم بود تا فرآورده PCR مرتبط با DNA ژنومی والدین توالییابی شوند. خالص سازي فرآوردههاي PCR با استفاده از کیت استخراج - QIAGEN, Mary land, USA - QIAGEN صورت گرفت. نمونههاي DNA براي توالییابی به دستگاه توالی یاب ABI Prism 3100-Avant Genetic Analyzer منتقل شدند. نتایج حاصله از توالییابی DNA ژنومی والدین با استفاده از نرمافزار Clastal W - http://www.ebi.ac.uk/clustal w/ - مورد مطالعه قرار گرفت.
از نتایج حاصل از همردیفی توالی DNA والدین بهمنظور پیدا کردن چندشکلیهاي تک نوکلئوتیدي - SNPs - ناشی از جهش هاي تک نقطه اي و جایگزین شدگی نوکلئوتیدي استفاده شد. براي تبدیل SNP شناسایی شده در والدین به چند شکلی طولی با استفاده از نشانگرهاي مبتنی بر PCR از روش CAPS و Pyrosequencing استفاده شد
جهت تعیین فواصل نشانگرها روي نقشه از تابع کوزامبی[11] برحسب سانتیمورگان استفاده گردید و تجزیه پیوستگی و ترسیم نقشه با استفاده از نرمافزار - v4.0, Kyazma B.V., Wageningen, Netherlands - JoinMap صورت گرفت.
