بخشی از مقاله
چکیده
خرفه یکی از گیاهان دارویی مهم است که داراي متابولیتهاي ثانویهي با ارزشی مانند دوپامین و نورآدرنالین میباشد. بسیاري از گونههاي گیاهی به آگروباکتریوم رایزوژنز حساس میباشند و تلقیح آنها با این باکتري منجر به القاي ریشه-هاي مویین میگردد . با استفاده از کشت ریشههاي مویین در بیورآکتور ممکن است بتوان میزان رشد و متابولیتهاي ثانویهي این ریشهها را افزایش داد. در این تحقیق ریشههاي مویین گیاه خرفه با استفاده از آگروباکتریوم رایزوژنز سویه AR15834، از ریزنمونههاي برگی 14 روزه تولید شد و جهت تأیید تراریختی این ریشهها، حضور ژن rolB در لاینهاي ریشه مویین توسط PCR و با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی ژن rolB بررسی شد.
کشت ریشههاي مویین در بیورآکتور آزمایشگاهی به منظور افزایش میزان رشد و متابولیتهاي ثانویه آنها انجام شد و مقدار تولید دوپامین و نورآدرنالین و رشد ریشهها مورد بررسی قرار گرفت. مقدار دوپامین و نورآدرنالین در ریشههاي مویین خرفه توسط HPLC اندازهگیري شد . مشاهده شد که مقدار متابولیتهاي ثانویه دوپامین و نورآدرنالین حدود 2/5 برابر نسبت به ریشههاي کشت شده در ارلن - شیک فلاسک - افزایش پیدا کرد. همچنین وزن خشک ریشههاي کشت شده در بیورآکتور تقریبا 3 برابر ریشههاي شاهد بود که نشان دهندهي رشد بیشتر و سریعتر ریشههاي کشت شده در بیورآکتور میباشد.
مقدمه
بسیاري از متابولیتهاي ثانویه توسط گیاهان تولید میشوند که در ساخت داروها و همچنین درمانهاي جدید کاربرد دارند. اما سنتز شیمیایی بسیاري از این متابولیتها مشکل، پرهزینه و یا غیر ممکن است. با توجه به اینکه در طبیعت سرعت تولید متابولیتهاي ثانویه کند بوده و مدت زمان طولانی براي تولید لازم است، استفاده از روشهاي بیوتکنولوژي براي تولید سریع و انبوه متابولیتهاي ثانویه و مواد دارویی ضروري به نظر میرسد - اصغري، . - 1385 با استفاده از پیشرفتهاي بیوتکنولوژي، تولیدات طبیعی گیاهان میتوانند منبع عظیمی از ترکیبات شیمیایی جدید با منشاء گیاهی را براي کاربردهاي گوناگون فراهم کنند.
گیاه خرفه - Portulaca oleracea L. - یکی از گیاهان دارویی مهم میباشد که سازمان بهداشت جهانی1 به آن لقب اکسیر جهانی2 داده است و داراي متابولیتهاي ثانویهي با ارزشی مانند دوپامین و نورآدرنالین میباشد. این گیاه با نام علمی Portulaca oleracea L. و اسم انگلیسی Purslane گیاهی یکساله از خانواده خرفه - Portulacaceae - است که برگهاي گوشتی و بذرهاي سیاه ریز دارد و ارتفاع آن در مراحل بذردهی تا حدود 40 سانتیمتر میرسد.
این گیاه به طور گسترده در دنیا توزیع شده است - بیرنه3و همکاران، - 1975 و به عنوان دیورتیک، ضد تب، شلکننده عضلانی، آنتی اکسیدان، تصفیه کننده خون، جلوگیري از حمله قلبی و تقویت سیستم ایمنی کاربرددرمانی دارد - آخوندزاده ،. - 1379 ریشههاي مویین4 کشت متمایزي از ریشههاي تراریخت میباشند که در اثر آلودگی گیاهان زخمی با باکتري گرم منفی و خاکزي آگروباکتریوم رایزوژنز5 تولید میشوند. سرعت رشد بالا در محیط بدون هورمون، پایداري ژنتیکی و دستورزي ژنتیکی آسان از خصوصیات این ریشهها میباشد - پیستلی6 و همکاران، . - 2011 توانایی باکتري آگروباکتریوم رایزوژنز در القاي ریشه-هاي مویین در تعدادي از گیاهان منجر به استفاده از این ریشهها به عنوان منبعی براي تولید فرآوردههاي دارویی شده است.
تراریختی مواد گیاهی با سویههاي آگروباکتریوم رایزوژنز در شرایط این ویترو به غلبه بر برخی مشکلات بزرگ در کشت ارگان گیاهی در شرایط این ویترو اجازه داده است و منجر به دستیابی به رشد سریع اندامها، نمایش شاخه زایی وسیع و قابلیت تولید متابولیتهاي اصلی از گیاه مادري یا حتی متابولیتهاي جدید غیر قابل تشخیص در گیاه مادري شده است. بنابراین ریشه مویین یک تکنولوژي امید بخش براي تولید متابولیتهاي ثانویه از جمله تروپان آلکالوئیدها و بسیاري از متابولیتهاي دیگر فراهم آورده است - نادر8 و همکاران،. - 2006
بیورآکتور دستگاه یا سیستمی است که یک محیط فعال بیولوژیک را فراهم میکند. کشت ریشههاي مویین تراریخت شده در بیورآکتور یک مدل پایدار ژنتیکی و بیوشیمیایی براي سنجش ساخت و بالا بردن محصولات طبیعی مهم دارویی است. توانایی رشد سریع ریشههاي مویین براي تولید دامنه وسیعی از مولکولهاي آلی مزیتهاي بیشتري در مقایسه با روشهاي مرسوم در مزرعه و کشتهاي سوسپانسیون سلولی دارد.
توانایی ریشه مویین براي رشد کردن با تراکم بالا و تولید مقادیر معنیداري از متابولیتهاي ثانویه نیز آنها را یک سیستم مناسب براي کشت در حد وسیع در رآکتور ساخته است. ریشههاي کشت شده در بیورآکتورها قادر به آزادسازي ترکیبات فعال دارویی مختلفی مانند داروهاي ضد سرطان از گونههاي مختلف تاکسوس در محیط مایع میباشد که در تولید انبوه جهت استفادههاي دارویی استخراج میشود - تریپاتی9 و تریپاتی، . - 2003 بررسیهاي زیادي بر روي بهینهسازي این سیستمها جهت تولید و استخراج ترکیبات گیاهی باارزش از جمله شیکونین انجام شده است.
فاکتورهاي زیادي در حین تکثیر هر نوع کشت سلولی تأثیر میگذارند که شامل میزان انتقال اکسیژن، انتقال گرما، حجم هواي مرتبط با کشت و سن و پایداري کشت هستند.تاکنون چندین نوع رآکتور براي کشتهاي ریشه مویین بهینه سازي شده است که شامل رآکتورهاي فاز مایع - مثل تانکهاي همزن، ستون حباب، راکتورهاي هوا بالا دهنده - ، رآکتورهاي فاز گاز و رآکتورهاي هیبرید هستند - سورت1 و همکاران، . - 2003
مواد و روشها
به منظور تولید گیاهچه با استفاده از کشت درون شیشهاي، بذرهاي گیاه خرفه ضدعفونی شده وسپس کشت شدند. به این ترتیب که بذرها ابتدا با آب شسته شدند، سپس به مدت 30 ثانیه در اتانول 70 درصد غوطهور شدند، پس ازشستشو با آب مقطر استریل، در محلول هیپوکلریت سدیم 2 درصد به مدت 15 دقیقه غوطهور گردیدند. پس از آن بذرها 3 بار با آب مقطر استریل به مدت 5 دقیقه شستشو داده شدند. سپس در پلیتهاي حاوي محیط 1/2 MS مایع کشت شدند. پلیتها به اتاق رشد با شرایط دمایی 25 درجه سانتیگراد و دوره نوري 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی منتقل شدند.
پس از جوانه زدن بذرها، ازگیاهچههاي 14 روزه - شکل 1،الف - ، ریزنمونههاي برگی - شکل 1، ب - تهیه شدند. بر روي سطح هر ریزنمونه با سر سوزن 2 الی 3 خراش سطحی ایجاد گردید - شکل 1، ج - . سپس ریزنمونهها در سوسپانسیون باکتري - شکل 1، ه - آگروباکتریوم رایزوژنز سویه AR15834 - شکل 1، د - - حاوي باکتري کشت شده در محیط LB که OD محیط در طول موج 600 نانومتر بین 0/5 تا 1 تنظیم شد - به مدت 20 دقیقه تلقیح شدند.
ریزنمونهها به منظور همکشتی با باکتري بر روي محیط 1/2 MSجامد کشت شدند - شکل 1، ي - و به مدت 2 روز در شرایط تاریکی و دماي 25 درجه سانتی-گراد در اتاق رشد قرار گرفتند. پس از 48 ساعت، به منظور حذف باکتري اضافی، ریزنمونهها 3 بار با آب مقطر استریل شستشو داده شدند و بر روي محیط 1/2 MSجامد حاوي 250mg/L آنتیبیوتیک سفاتوکسیم - حل شده در آب مقطر دیونیزه و فیلتر شده با فیلتر 0/2 میکرون - قرار داده شدند.
