بخشی از مقاله
چکیده
ژن مولد سم ریسین Ricin داراي منشأ گیاهی است. Ricin به صورت یک هترودایمر بوده و از دو زیر واحد متفاوت تشکیل و به وسیله یک باند دي سولفیدي به همدیگر متصل میشوند. ] RTA زیر واحد [ A جزء سمی محسوب شده و با فعالیت گالاکتوزیدازي خود باعث تخریب RNA ریبوزوم ها شده و با این عمل سبب مهار سنتز پروتئین میگردد . RTB قسمت غیر سمی ریسین است که به رسپتور خود در سطح سلولها متصل شده و سبب ورود RTA به درون سلول میشود. توکسین - RTB - B ریسین یک لکتین اختصاصی براي گالاکتوز بوده که به عنوان یک ادجوانت و حامل براي آنتی ژنها در واکسنهاي خوراکی عمل میکند.
DNA ژنومی گیاه کرچک به روش CTAB تخلیص شد. قطعه 786 جفت بازي ژنRTB با جایگاههاي آنزیمیSalI و HindIII توسطPCR تکثیر و به کلونینگ وکتور همسانه سازي و بعد از جداسازي به وکتور - pET28a - + با جایگاههاي آنزیمیSalI و NotI همسانه سازي و به باکتري E.coli سویه - Rosetta - DE3 ترانسفورم شد. RTB کلون شده در وکتور بیانی - pET28a - + به وسیلهي توالی یابی، PCR و آنالیز آنزیمی همچنین پروتئین تولیدي به وسیله SDS-PAGE مورد تأیید قرار گرفت. بیان ژن RTB با القاي IPTG انجام و پروتئین تولید و تخلیص شده توسط وسترن به لات تایید گردید.
.1 مقدمه
ژن مولد سم ریسین Ricin داراي منشأ یوکاریوتی بوده و سمی بسیار مهلک و خطرناك میباشد . Ricin را از گیاهی به نام Ricins communis یا همان کرچک میگیرند . ریسین یک لکتین گیاهی محسوب میشود که تمایل زیادي براي اتصال به ملکولهاي قند دارد. Ricin یک هترودایمر است که از دو زیر واحد متفاوت تشکیل شده است 1]، 2، 3 و ] RTA .[4 زیر واحد [ A جزء سمی محسوب شده و با فعالیت گالاکتوزیدازي [ galoctozidase ] خود باعث تخریب RNA ریبوزوم ها شده و با این عمل سبب مهار سنتز پروتئین میگردد .
RTB قسمت غیر سمی ریسین است که به رسپتور خود در سطح سلولها متصل شده و سبب ورود RTA به درون سلول میشوند. RTB و RTA به عکس سموم ذکر شده در بالا ، توسط پیوندهاي محکم کووالان ] از نوع دي سولفیدي [ به هم متصل شدهاند1]، 2، 4وRTB .[5 ملکولی است غیر سمی با وزن ملکولی 34kDa و داراي ژنی به اندازه ] 782 جفت باز [ که از خانواده لکتین ها بوده و تمایل زیادي براي اتصال به قند گالاکتوز [ Gal ] و –N استیل گالاکتوزآمین موجود در گلیکوپروتئین ها و گلیکولیپیدها در سطح سلولها دارد
RTB ملکولی مفید به عنوان ناقل مخاطی [ Mocusal carrier ] و یاور محسوب میشود. RTB یک حامل خوب براي داروهاي ضد سرطانی در شیمی درمانی] مثل دي هیدروفولات ردوکتاز[ محسوب میگردد.[5] مطالعات زیادي بر روي RTB انجام گرفته است و در موجودات زیادي ترانسفورم گردیده است.RTB نیز مانند بقیه ژنهاي انتقال دهنده به عنوان ایمونوادجوان مخاطی و به عنوان ناقل براي ژن P24 بیماري ایدز به کار گرفته شده است 5] و.[12 این تحقیق با هدف دستیابی به همسانهسازي و بیان این آنتیژن یوکاریوتی در E. coliو تولید آنتی بادي پلی کلونال درموش بود که با موفقیت انجام گرفت.
. 2 مواد و روشها
.1-2 طراحی پرایمر ژن RTB مربوط به گیاه کرچک
توالی کامل سم ریسین گیاه کرچک از بانک ژن - NCBI-Xo3179 - استخراج شد و به کمک نرم افزار primer3# طراحی پرایمر صورت گرفت. پرایمر آغازین داراي جایگاه شناسایی آنزیم محدودالاثرSalI و پرایمر پایانی داراي جایگاه شناسایی آنزیم محدودالاثرHindIII است که به وسیله BIOLABS_NEB-cutterتعیین شد. پرایمرهاي آغازین و پایانی به ترتیب در زیر آورده شده است.
.2-2 تکثیر ژن RTB با روش PCR
DNA ژنومی برگ کرچک به روش CTAB1 استخراج و با استفاده از اسپکتروفتومتري تعیین غلظت گردید و به عنوان الگو در واکنش PCR استفاده شد. واکنش PCR براي تکثیر ژن RTB ابتدا با آنزیم Taqپلی مراز - سیناژن - در غلظت 2 میلی مولار MgCl2 ،0/4 پیکو مول از هر پرایمر،0/2 میلی مولار dNTPsو در دماي اتصال 58 درجه سانتی گراد بهینه سازي شد.
به منظور جلوگیري از جهشهاي ناخواسته تکثیر نهایی ژن با استفاده ار آنزیم Pfu پلی مراز فرمنتاز در حجم 25 میکرولیتر صورت گرفت. هر واکنش PCR شامل 0/4 پیکومول از هر پرایمر،0/2 میلی مولار dNTPs، 0/25 واحد آنزیم DNA پلی مراز Pfu ، 2/5 میکرولیتر بافر 10XPCR و MgSo4 با غلظت نهایی 2/5 میلی مولار و 50 نانوگرم از ژنوم استخراج شده برگ کرچک بود. چرخههاي PCR شامل یک مرحله واسرشت شدن ابتدایی در دماي 94 درجه سانتی گراد به مدت 45 ثانیه، اتصال پرایمر به رشته الگو در دماي 61 درجه سانتی گراد به مدت 40 ثانیه و تکثیر قطعه مورد نظر در دماي 72 درجه سانتی گراد به مدت یک دقیقه و در پایان یک مرحله تکثیر نهایی در دماي 72 درجه سانتی گراد به مدت 7 دقیقه بود
. 3-2 همسانه سازي قطعه حاصل از واکنش PCR
محصول PCR روي ژل آگارز - سیناژن - مورد تایید و از ژل تخلیص و به انتهاي آنها نوکلوتید A اضافه شد. براي همسانه سازي و ترانسفورم از وکتور کلونینگ pEGM-T Easy Vector پرومگا و سلولهاي مستعد E. coli سویهDH5α استفاده شد. سپس قطعات توسط آنزیمهاي برشی SalI و NotI از ناقل TA کلونینگ جداسازي و در وکتور بیانی - pET28a - + کیاژن همسانه سازي و در سلولهاي مستعد E.coli سویه - BL21 - DE3 - - stratagen ترانسفورم شد. کلونهاي حاوي قطعه مورد نظر به کمک PCR و هضم آنزیمی و در نهایت با تعیین توالی تایید شد.
.4- 2 بیان ژن RTB
از کشت شبانه کلونهاي جداسازي شده میزان 100 میکرولیتر به 5 میلی لیتر محیط LB مایع تلقیح و پس از رسیدن OD 0/6 در طول موج 600 نانومتر - براي بدست آوردن میزان رشد باکتري - ، ماده القا کننده پروموتر - IPTG - فرمنتاز با غلظت 1 میلی مولار به محیط کشت افزوده و به مدت 5 ساعت در دماي 37 درجه سانتی گراد انکوبه شد.
.5 -2 الکتروفورز SDS-PAGE
نمونهها قبل و بعد از القاي IPTG، همراه با مارکر پروتئینی - - SM0671تحت شرایط دناتوره، الکتروفورز شدند. غلظت ژل %12 با جریان ثابت 25 میلی آمپر بود.
.6-2 تایید پروتئین نوترکیب
براي تایید پروتئین نوترکیب بیان شده از تکنیک وسترن به لات با آنتی بادي ضد برچسب هیستیدین استفاده شد. عصاره سلولی پس از بیان با استفاده از سیستم وسترن بلاتینگMini Protean - Bio-rad - و بافر انتقال - گلایسین39 میلی مولار، تریس 48 میلی مولار،0/%037 SDSو متانول - %20روي کاغذ نیتروسلولز منتقل شد.
کاغذ نیترو سلولز با استفاده از بافر 37 NaCl - PBST میلی مولار،2/7 KCl میلی مولار،4/3Na2HPO4.7H2O میلی مولار، تویین%5 20و pH:7/2 - حاوي %5 شیر خشک به مدت 2 ساعت در دماي اتاق بلاك گردید. نمونه پس از سه بار شست شو با بافر PBST به مدت یک ساعت با رقت 1/800 آنتی بادي ضد برچسب هیستیدین در بافر PBST در دماي اتاق مجاور شد. نمونه پس از شست شو مجدد با بافر PBST ، به مدت یک ساعت با رقت 1/2000 از آنتی بادي کانژوگه موشی Dako - - در بافر PBST در دماي اتاق قرار گرفت و در نهایت پس از سه بار شست شو با بافر PBST ، براي آشکار سازي از بافر تریس50mM حاوي 6mg DAB، 10µl H2O2استفاده شد. واکنش با استفاده از H2SO4 متوقف گردید.
.3 نتایج
.1- 3 تکثیر ژن RTB
پس از تکثیر ژن PA به روش PCR، محصول روي ژل آگارز مورد ارزیابی قرار گرفت و همانطور که در شکل 1 مشاهده میشود قطعه مورد نظر از لحاظ اندازه با ژن هدف ما همخوانی داشت - 786 جفت باز - .
شکل:1 نتایج محصول PCR ژن RTB روي ژل آگارز - %1 ستون:L مارکر - 3kbp ستون4،3،2،:1 ژن RTB
.2 -3 هضم آنزیمی پلاسمید حاوي ژن RTB
پس از تخلیص پلاسمید و تأیید آنها روي ژل آگاروز، پلاسمیدها با دو آنزیم SalIو NotI هضم شدند سپس به کمک مارکر، اندازة قطعه خارج شده از وکتور تأیید شد. شکل 1، محصول هضم آنزیمی را نشان می دهدکه قطعه مورد نظر میباشد
