بخشی از مقاله
خلاصه
علف هاي هرز شامل بخش قابل توجهی از آفات کشاورزي هستند. راهکار اصلی کنونی مقابله با علف هاي هرز استفاده از علف کش هاي شیمیایی است که مشکلات زیادي از جمله آلوده کردن محیط زیست و بروز مقاومت را به همراه داشته است. به همین دلیل امروزه استفاده از علف کش هاي زیستی مورد توجه دانشمندان است . پروتئین Nep-1 می تواند به عنوان علف کش زیستی در نظر گرفته شود. این پروتئین ضمن بی اثر بودن بر گیاهان زراعی تک لپه به طور موثري روي علف هاي هرز دولپه اي موثر است.
در این پژوهش mRNA کد کننده این ژن از قارچ مولد آن یعنی Fusarium oxysporum جدا شده و c-DNA آن ساخته شد و ژن حاصل در ادامه در میزبان باکتریایی E. coli کلون و بیان گردید. در ادامه پروتئین نوترکیب تولید شده خالص سازي شده و پس از بازآرایی ساختار آن به شکل فعال در آورده شد. به منظور ارزیابی فعالیت پروتئین نوترکیب از گیاه هرز خردل وحشی استفاده شد که نتایج بدست آمده نشان داد که اسپري آن در غلظت 50 µg/ml می تواند به طور موثري باعث مرگ گیاه شود. نتایج بدست آمده نشان داد که می توان به طور موثري از پروتئین Nep-1 نوترکیب به عنوان علف کش زیستی استفاده کرد.
مقدمه
سالانه %20 از محصولات کشاورزي تولید شده در دنیا توسط آفات از بین می روند - 1 و. - 4 مهمترین راهکار بشر جهت مبارزه با این معضل استفاده از آفت کش هاي شیمیایی است، اما به دلیل مشکلات زیست محیطی فراوان و غیر اختصاصی بودن این ترکیبات، امروزه استفاده از آفت کش هاي زیستی در کانون توجه دانشمندان و طرفداران محیط زیست قرار گرفته است - 4 و. - 6 پروتئین Nep-1 یک علف کش زیستی موثر است که به طور طبیعی توسط قارچ بیماري زاي گیاهی Fusarium oxysporum تولید می شود - . - 2
این پروتئین اثرات سمی و کشنده بروي گیاهان دو لپهاي داشته و فاقد هر گونه اثرسمی شناخته شده بروي گیاهان تک لپه اي است - 3 و. - 4 از آنجاکه بیشتر محصولات کشاورزي مهم همچون برنج، گندم، جو، ذرت و غیره به صورت گیاهان تک لپه اي و علف هاي هرز اصلی این مزارع از جمله دولپه اي ها هستند، پروتئین Nep-1 به عنوان یک علف کش زیستی موثر در این مزارع در نظر گرفته شده است - 1 و . - 5 هدف از انجام این تحقیق تولید باکتري نوترکیب مولد پروتئین Nep-1 و خالص سازي محصول تولید شده و در نهایت بررسی فعالیت زیستی محصول تولید شده در گیاه هرز خردل وحشی به عنوان علف هرز مدل است.
مواد و روش ها کشت قارچ و جداسازي ژن
براي جداسازي ژن سویه استانداردFusarium oxysporum f. sp. lycopersici DSM:62060 از بانک میکروبی آلمان خریداري شد و اسپور هاي آن در محیط CZAPEK DOX broth به همراه %1 کازآمینواسید به مدت 5 روز کشت داده شد. در ادامه با روش RT-PCR و با کمک پرایمرهاي F 5”ATgCATCCTCAgACCATCTTCA’3 و R 5” TCAggACCAggCCTTgTTg’3 ژن nep-1 جداسازي و تعیین توالی شد.
انتقال ژن و وکتور بیانی pET16b و انتقال آن به E.coli BLDE3
به منظور بیان پروتئین ژن کلون شده با آنزیم هاي XhoI و BamHI بریده شده و داخل وکتور بیانی pET16b انتقال داده شد و پلاسمید هاي نوترکیب از طریق الکترپوریشن به داخل سلول هاي شایسته E. coli BLDE3 انتقال داده شد. در ادامه براي ارزیابی درستی ساختار بیانی نهایی از طریق تعیین توالی مورد تایید قرار گرفت.
بیان پروتئین و خاص سازي و بازارآیی پروتئین
کلون هاي نوترکیب بهدست آمده با استفاده از روش SDS-page مورد بررسی قرار گرفته تا توان تولید پروتئین در آنها ارزیابی شد. و از میان کلون هاي بدست آمده بهترین آن انتخاب گردید. در ادامه به منظور خالص سازي پروتیئن نوترکیب با توجه به دنباله هیستیدنی انتهاي آمینی آن ، از ستون هاي کروماتوگرافی Ni-NTi ساخت شرکت اینویتروژن استفاده شد. با توجه به تولید پروتئین به صورت اینکلوژن بادي، بازآرایی ساختار پروتیئن با کمک کیت بازآرایی مجدد پروتیئن ساخت شرکت نواژن انجام و پروتیئن بهدست آمده با روش برادفورد تعیین مقدار شد.
سنجش فعالیت زیستی پروتئین برروي گیاه هرز
به منظور ارزیابی فعالیت زیستی پروتئین نوترکیب تولید شده از گیاه هرز خردل وحشی کشت داده شده در محیط MS استفاده شد. به این منظور غلظت هاي مختلف پروتیئن برروي برگهاي گیاه اسپري شد و در طول 5 روز فعالیت آن مورد ارزیابی قرار گرفت.
نتایج جداسازي ژن از منبع قارچی
از انجا که ژن nep-1 قارچی حاوي یک توالی 58 نوکلئوتیدي اینترون است در ابتدا RNA قارچی استخراج و در مرحله دوم با واکنش RT-PCR کتابخانه c-DNA از آن تهیه شد. در ادامه نیز ژن جدا شده با کمک پرایمرهاي اختصاصی PCR و جداسازي شد. قطعه مورد نظر 750 نوکلئوتیدي در شکل زیر مشاهده می شود قطعه بدست آمده در ادامه تعیین توالی شده و مورد تایید قرار گرفت.
کلون ژن در pUC19 و pET16b در میزبان E.coli در ادامه قطعه بدست آمده در درون وکتور کلونینگ pUC19 به صورت انتهاي صاف و سپس در درون وکتور بیانی pET16b با انتهاي چسبده انتقال داده شد. pUC19 نوترکیب و pET16b نوترکیب به ترتیب در داخل میزبان E. coli novablue و داخل میزبان بیانی E. coli BLDE3 انتقال داده شد. در شکل زیر پلاسمید استخراج شده pUC19 نوترکیب مشاهده می شود.
بیان پروتئین و خالص سازي آن
به منظور ارزیابی تولید پروتئین نوترکیب از SDS-page استفاده شد. در شکل زیر نمونه شاهد فاقد ژن مورد نظر و یک نمونه کلون مثبت تولید کننده مشاهده می شود.
