بخشی از مقاله
چکیده
توانایی کنترل کنندگی چهار جدایه PTCC 5204، PTCC 5269، PTCC 5051 و PTCC 5052 از مخمر Saccharomyces cerevisiae بر روي کپک خاکستري سیب ناشی B.mali مورد ارزیابی قرار گرفت . در شرایط آزمایشگاه در آزمون کشت متقابل ، جدایه هاي آنتاگونیست 23/623 تا 45/655 درصد از رشد کلونی هاي B.mali جلوگیري نمودند . در آزمایش هاي انبار از سیب رقم Golden Delicious استفاده گردید .
غلظت هاي مایه کوبی شده عامل بیماري و آنتاگونیست به ترتیب 1×105 spores/ml و 1 × 107 cfu/ml بود . چهار آنتاگونیست به طور معنی داري مساحت لکه هاي حاصل از پوسیدگی کپک خاکستري روي سیب را بعد از 9 روز در 20 درجه سانتی گراد و 25 روز در 4 درجه سانتی گراد کاهش دادند.جدایه PTCC 5269 در هر دو دما بیشترین میزان کنترل کنندگی را دارا بود .
مقدمه
پوسیدگی هاي بعد از برداشت سیب که عمدتا به وسیله Penicillium expansum ، Botrytis cinerea ایجاد می شود حتی در مناطق تولیدي که تکنولوژي هاي پیشرفته انبارداري به کار گرفته می شود موجب ایجاد خسارت می شوند. معمولا قارچ کش ابزارهاي اصلی براي کنترل بیماري هاي بعد از برداشت می باشند
افزایش نگرانی در مورد به خطر افتادن سلامت محیطی - 17 - ، توسعه استرین هاي مقاوم عوامل بیماري زا به قارچ کش ها - - 14 و عدم ثبت بعضی قارچ کش هاي مؤثر - - 7 موجب ایجاد وگسترش روش هاي غیرشیمیایی براي کنترل بیماري هاي بعد از برداشت شده است . کنترل بیولوژیک با استفاده ازآنتاگونیست هاي میکروبی - 16 - به عنوان یکی از امید بخش ترین راه هاي کنترل بیماري هاي بعد از برداشت ظهور پیدا کرده است . در این رابطه تعدادي از مخمرهاي جدا شده براي حفاظت انواعی از میوه ها بر علیه عوامل بیماري زاي بعد از برداشت مؤثر واقع شده اند
ما در این تحقیق به بررسی پتانسیل چهار جدایه Saccharomyces cerevisiae براي کنترل کپک خاکستري سیب پرداختیم .
مواد و روش ها
جدایه Botrytis mali BM2 در بین چند جدایه Botrytis که در اختیار داشتیم قویترین جدایه بود . جدایه هاي PTCC 5204 ، PTCC 5269 ، PTCC 5051 و PTCC 5052 از مخمر Saccharomyces cerevisiae از پژوهشکده بیوتکنولوژي مرکز کلکسیون قارچ ها و باکتري هاي عفونی و صنعتی ایران دریافت شد و در این آزمایش ها مورد استفاده قرار گرفت .
در تمام آزمایش ها سیب رقم Golden Delicious براي ارزیابی پتانسیل آنتاگونیستی جدایه هاي مخمر روي میوه استفاده شد.
براي انجام آزمایش ها مخمر ها در ارلن هاي 250 میلی لیتري حاوي 50 ml محیط - NYDB - Nutrient yeast dextrose broth کشت داده شده و به مدت 48 ساعت در دماي اتاق روي شیکر با 200 rpm قرار داده شدند .به منظور بررسی اثر آنتاگونیست ها روي رشد قارچ عامل بیماري در شرایط آزمایشگاه ، از آزمون کشت متقابل - 2 - و آزمون متابولیت هاي فرار - 10 - استفاده شد . در هر دو آزمایش پتري دیش هاي حاوي قارچ عامل بیماري به تنهایی به عنوان شاهد در نظر گرفته شدند . پتري دیش ها در دماي 25 درجه سانتی گراد نگهداري شدند و سپس قطر کلونی ها اندازه گیري شده و درصد بازدارندگی با فرمول زیر محاسبه گردید .
= n درصد بازدارنگی از رشد عامل بیماري = a مساحت کلونی عامل بیماري در پتري شاهد = b مساحت کلونی عامل بیماري در پتري تیمار
آزمایش ها در قالب طرح کاملا تصادفی انجام شد . داده هاي به دست آمده با نرم افزار SAS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفته و با استفاده از آزمون دانکن - P≤0.05 - گروهبندي گردید .
براي بررسی اثر مخمرها در کنترل بیماري در روي سیب ابتدا سیب ها در محلول هیپوکلریت سدیم %2 ضدعفونی شده و دو بار با آب مقطر استریل شستشو داده شده و سپس به مدت 5 ثانیه در الکل اتیلیک %70 غوطه ور شدند. پس از خشک شدن سیب ها در معرض هوا روي هر سیب سه زخم به قطر 3 mm و عمق 5 mm ایجاد شد . اینوکلوم مخمر در محیط NYDB به روش توضیح داده شده تهیه گردید.
سلول هاي مخمر با سانتریفیوژ در 3500 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه از محیط جدا شده و دو بار با آب مقطر استریل شستشو داده شدند .سوسپانسیون مخمر با استفاده از هماسیتومتر در غلظت 107 سلول در میلی لیتر تنظیم شد . زخم ها با 50 µl سوسپانسیون سلولی مخمر یا آب مقطر استریل تیمار شدند و بعد از 4 ساعت 20 µl سوسپانسیون عامل بیماري در غلظت 105 اسپور در میلی لیتر در داخل هر زخم مایه کوبی شد . زخم هاي مایه کوبی نشده با آب مقطر استریل تیمار شدند . سیب هاي تیمار شده در جعبه هایی گذاشته و درون کیسه هاي پلاستیکی قرار داده شدند .با اسپري کردن آب استریل در درون کیسه ها رطوبت نسبی داخل آنها در سطح بالایی نگه داده شد .هر تیمار در 4 تکرار انجام شد . سیب ها در دماي 20 یا 4 درجه سانتی گراد نگهداري شدند .بعد از طی دوره نگهداري زخم ها از نظر ایجاد پوسیدگی بررسی شده و قطر لکه ها با استفاده از کولیس اندازه گیري و مساحت آنها محاسبه شد .
آنالیز آماري داده ها به صورت طرح فاکتوریل در قالب کاملا تصادفی انجام شده و داده هاي به دست آمده با نرم افزار SAS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفته و با استفاده از آزمون دانکن - P≤0.05 - گروهبندي گردید .
نتایج و بحث
4 جدایه مخمر تست شده در کشت متقابل 23/623 تا 45/655 درصد از رشد میسلیومی B.mali جلوگیري کردند - جدول. - 1 در آزمون متابولیت هاي فرار چهار جدایه تفاوت معنی دار داشته و جدایه PTCC 5204 با 55/568 درصد بیشترین میزان کنترل کنندگی را دارا بود
در هر دو دماي 4 و 20 درحه سانتی گراد تیمار ها با شاهد تفاوت معنی دار داشتند - جدول . - 2 در هر دو دما جدایه PTCC 5269 مؤثرترین و جدایه PTCC 5051 کم اثرترین جدایه در کنترل کپک خاکستري سیب بودند ، این در حالی است که جدایه PTCC 5269 در کشت متقابل و آزمون متابولیت هاي فرار دومین سطح کنترل کنندگی را داشته و جدایه PTCC 5051 در کشت متقابل نسبت به جدایه PTCC 5269 کنترل کنندگی بهتري داشت . نتایج حاصل نشان می دهد که احتمالا مکانیسم کنترل کنندگی جدایه هاي مخمر روي کپک خاکستري سیب تولید آنتی بیوتیک یا متابولیت هاي فرار نبوده است .
عدم استفاده از آنتی بیوتیک ها توسط مخمرهاي آنتاگونیست در کنترل بیماري روي میوه توسط محققان دیگر نیز ثابت شد
تحقیقات ما - 10 - نشان می دهد که رابطه معینی بین خاصیت کنترل کنندگی مخمرها و متابولیت هاي فرار آنها تشخیص داده نشده است و براي تعیین چنین رابطه اي تحقیقات بیشتري مورد نیاز است.در پژوهش هاي انجام شده از کلونیزاسیون سریع زخم ها به وسیله مخمرها و رابطه کمی بین جمعیت مخمرها و اثر بیوکنترل آنها و همچنین عدم تولید متابولیت هاي ضد قارچی در ارزیابی هاي - 13 - invitro به این نتیجه رسیده اند که مکانیسم آنتاگونیستی مخمرها رقابت غذایی می باشد .
هر چند عدم تاثیر بازدارندگی در ارزیابی هاي آزمایشگاهی تولید متابولیت توسط مخمرها در زخم هاي سیب را رد نمی کند - . - 6 احتمالا مخمرها از ترکیبی از مکانیسم هاي رقابت غذایی و مکانی ، پارازیتیسم مستقیم ، تولید آنزیم هاي لیتیک و القاي مقاومت براي کنترل بیولوژیک استفاده می نمایند - . - 3 ونگ و همکاران در سال 2004 گزارش
کردند که Cryptococcus laurentii آنزیم هاي آنتی اکسیدانت را در میوه هلو القا می کند
جدول :1 درصد بازدارندگی از رشد میسلیومی B.mali توسط جدایه هاي S .cerevisiae در آزمایشگاه
جدول : 2 مساحت لکه هاي ایجاد شده توسط B.mali روي سیب
میانگین هایی که در هر ستون با حروف مختلف نشان داده شده اند در آزمون دانکن - p≤0.05 - اختلاف معنی دار دارند
