پاورپوینت تشخیص با سیل های گرم منفی در عفونت ادرای

بخشی از پاورپوینت

اسلاید 1 :

تشخیص با سیل های گرم منفی در عفونت ادرای

بسم الله الرحمن الرحیم

اسلاید 2 :

اولین اقدام جهت شناسایی باکتری تهیه ی گسترش و رنگ آمیزی می باشد. بدین منظور ابتدا یک قطره سرم فیزیولوژی استریل بر روی لام (مرکز لام ) قرار داده سپس با یک آنس استریل یک قسمت کوچک از کلونی مورد نظر را برداشته در قطره سرم فیزیولوژی حل نموده بصورت شیرابه در سطح لام به اندازه وضخامت مناسب پخش می نماییم.پس از خشک شدن با کمک حرارت ملایم شعله فیکس نموده ولام آماده برای رنگ آمیزی می باشد.
تهیه گسترش ورنگ آمیزی باکتری

اسلاید 3 :

روش ساخت کریستال ویوله
20 گرم کریستال ویوله رادر100 میلی لیتر اتانول 95 درصد حل کرده بنام محلول A
یک گرم اگزالت آمونیوم رادر100 میلی لیتر آب مقطرحل کرده بنام محلول B
محلول A رابه نسبت 1 به 10 رقیق کرده وبا 4 برابر محلول B مخلوط کرده صاف می نمایم
روش ساخت لوگول
یک گرم یدکریستال ودوگرم یدورپتاسیم راساییده ومخلوط می کنیم وسپس 300 میلی لیتر آب مقطر رابه آرامی به آن اضافه می کنیم
روش ساخت محلول بی رنگ کننده
250 میلی لیتر اتانول 95 درصد رابا250 میلی لیتر استون ترکیب کرده ودر شیشه های درب دار نگهداری می کنند .
سافرانین (رنگ مخالف)
2/5 گرم سافرانین رابا100 میلی لیتر اتانول 95 درصد مخلوط کرده ودرشیشه های درب دار نگهداری می کنند .
ساخت رنگ گرم

اسلاید 4 :

1- رنگ کریستال ویوله رابه مدت 30تا45 ثانیه برروی گسترش ریخته درنتیجه همه باکتری ها به رنگ بنفش درخواهد درآمد
2- پس از شستشو گسترش با آب به مدت 30تا45 ثانیه با لوگل می پوشانند لوگل باکریستال ویوله ترکیب شده وایجاد کمپلکس های بزرگی می نمایید که باعث تثبیت رنگ کریستال ویوله درداخل دیواره سلولی باکتری می شود . پس ازاین مرحله نیزکماکان همه باکتریها به رنگ بنفش مشاهده می شوند .

3-مرحله رنگ زدایی مهمترین مرحله رنگ آمیزی است دراین مرحله پس از شستشو لام با آب لام به مدت 15 تا20 ثانیه در معرض موادرنگ زدا مانند الکل استون قرار می گیرد سپس با آب مورد شستشو قرار می گیرد  . درباکتریهای گرم منفی که دارای لایه های پپتیدو گلیکان محدود وغشای خارجی غنی از چربی هستند این حلال باعث حذف این لایه ها وغشا می گردد وباکتری رنگ مراحل قبل راازدست می دهد . ولی درباکتریهای گرم مثبت به علت تعداد زیاد لایه های پپتیدوگلیکان وعدم وجود لیپید فراوان در غشا رنگ مرحله قبل ازغشا خارج نمی شود .درنتیجه پس ازاین مرحله باکتریهای گرم منفی بی رنگ ولی باکتریهای گرم مثبت کماکان بنفش باقی خواهند ماند .

4- در انتها سطح گسترش راباسافرانین یا فوشین (قرمز رنگ) به مدت 30 تا45 ثانیه می پوشانیم سپس باآب شستشو داده و پس از خشک شدن بامیکروسکوپ مورد بررسی قرار میگیرد . دراین مرحله باکتریهای بی رنگ به رنگ قرمز درمی آیند وباکتری های بنفش بدون تغییر رنگ باقی می مانند .
روش رنگ آمیزی گرم

اسلاید 5 :

گرم منفی
گرم مثبت

اسلاید 6 :

Triple Sugar Iron Agar(TSI Agar))
این محیط حاوی سه قند گلوکز،لاکتوز و ساکاروز می باشد معرف محیط فنل رد بوده وعلاوه بر آن حاوی سولفات فروز بوده که برای بررسی تولید سولفید هیدروژن استفاده می گردد. برای تفکیک باسیل های روده ای گرم منفی بر اساس تخمیر کربوهیدرات (تغییر رنگ در حضور معرف از قرمز به زرد) وتولید سولفید هیدروژن(سیاه شدن درعمق لوله) به کار میرود. غلظت گلوکز یک دهم (0.1) غلظت لاکتوز یا ساکاروز است.

اگر محیط در عمق لوله زرد شود(اسیدی)، اما در سطح شیب دار قرمز شود(قلیایی) ، ارگانیسم گلوکز مثبت می باشد. رنگ زرد در سطح شیب دار و عمق نشان می دهد که ارگانیسم مورد نظر گلوکز، لاکتوز و ساکاروز مثبت می باشد. رنگ قرمز در سطح شیب دار و عمق نشان می دهد که ارگانیسم تحت بررسی یک غیر تخمیر کننده است.

بعضی از میکرو ارگانیسم ها ممکن است در روی محیط کلیگلر آیرون آگار سولفید هیدروژن تولید کنند ولی در محیط سه قندی به دلیل وجود ساکاروز که در بعضی موارد مکانیسم آنزیمی تولید سولفید هیدروژن را مهار می کند ایجاد این گاز را نمی کنند مثل بعضی از سالمونلا ها و انتروباکتریاسه.
محیط های افتراقی جهت شناسایی باسیل های گرم منفی

اسلاید 7 :

TSI کنترل کیفی محیط

اسلاید 9 :

Urea agar

این محیط برای جدا سازی با کتری هایی که قادربه استفاده از اوره و تولید آنزیم اوره آز می باشند به کار می رود مانند پروتئوس و به دو صورت پایه آگار و پایه براث تهیه می شوند.

اسلاید 10 :

کنترل کیفی محیط اوره

اسلاید 12 :

MR-VP Broth
این محیط برای تفکیک باکتری ها براساس واکنش های متیل رد و وژس پروسکوئر به کار می رود .در این محیط با افزودن معرف آلفا نفتول به کشت های میکروبی که قادر به تولید محصول استوئین(استیل متیل کربینول) از تخمیر دکستروز(گلوکز) می باشند در حضور اکسیژن و قلیا اکسید می شود تا دی استیل را تولید کند که با کراتین واکنش می دهد ورنگ قرمز تولید می کند . این واکنش را وژس پروسکوئر مثبت گویند .

میکروب های متیل رد مثبت ، مقادیر زیادی اسید در طی تخمیر گلوکز تولید می کنند که بر سیستم بافری فسفات غلبه کرده و به محض افزودن معرف متیل رد رنگ قرمز تولید می کند .

اسلاید 13 :

:A1-محلول

5گرم آلفانفتول را در مقدار کمی الکل اتیلیک 95 درجه حل کرده وحجم آنرا بتدریج به 100 میلی لیتر می رسانیم .

:B2- محلول 40 گرم هیدروکسید پتاسیم را در 100ملی لیتر آب مقطر حل می کنیم و در یخچال .نگه می داریم

برای انجام تست ابتدا 6 قطره از معرف A و 2 قطره ازمعرف B را به لوله اضافه کرده و لوله راتکان می دهیم سپس به مدت 15 دقیقه لوله را بی حرکت قرار می دهیم پیدایش رنگ صورتی متمایل به قرمز نتیجه مثبت را نشان می دهد.

ساخت معرف آلفانفتول

اسلاید 14 :

0.1 گرم از پودر متیل رد را در 300 میلی لیتر الکل اتیلیک 95 درجه حل نموده وسپس 200 میلی لیتر آب مقطر به آن اضافه می کنیم. محلول را در ظرف قهوه ای نگهداری می کنیم .
پس از اضافه کردن چند قطره به محیط مورد نظر در صورت مثبت بودن قرمز رنگ می شود.
ساخت معرف متیل رد

اسلاید 15 :

MR-VPکنترل کیفی

اسلاید 17 :

Sulfide Indol Motility(SIM)
این محیط برای جداسازی باسیل های روده ای بر اساس تولید سولفید، اندول و حرکت به کار می رود.این مشخصه ها در شناسایی انتروباکتریاسه مخصوصاٌ سالمونلا وشیگلا کمک می کند .در این محیط تیوسولفات سدیم و سولفات آمونیم فروز معرف های سولفید هیدروژن ،معرف کواکس یا ارلیخ برای اندول که در اثر استفاده از پپتون کازئین که سرشار از تریپتوفان است به وجود می آید استفاده می شود و شناسایی حرکت به علت طبیعت نیمه جامد محیط امکان پذیر است.

اسلاید 18 :

SIMکنترل کیفی

اسلاید 19 :

2 گرم از پودر پارا دی متیل آمینوبنزآلدئید + 190میلی لیتر اتیل الکل + 40میلی لیتر اسید کلریدریک غلیظ برای آزمایش چند قطره از معرف کواکس را به سطح محیط اضافه می کنیم در صورت مثبت بودن حلقه قرمز رنگ بین محیط ومعرف الکلی ایجاد می گردد.چنانچه نتیجه منفی بود محیط را 24 ساعت دیگر برای بررسی نگه می دارند .

ساخت محلول کواکس یا ارلیخ