بخشی از پاورپوینت
اسلاید 1 :
موضوع سمینار: پنی سیلین gاسیلاز
اسلاید 2 :
تاریخچه کشف پنی سیلین
در سال 1928 ، باکتریولوژیست انگلیسی ، "الکساندر فلمینگ"، متوجه شد که استفیلوکوکوسهای متعددی که برای کشف در روی میز آزمایشگاه کنار گذاشته شده بودند، از طریق هوای آزمایشگاه به میکروارگانیسم آغشته شدهاند. یک کپک سبز پنیسیلیوم در بعضی از قسمتها رشد کرده ، استافیلوکوکوس در کنار آن متلاشی شده است. جسمی که باعث فعالیت آنتی بیوتیکی شد، پنی سیلین نامیده شد.
کشف پنی سیلین بهعنوان یک آنتی بیوتیک قوی با طیف وسیعی یکی از نقطههای عطف شیمی پزشکی است.
همانند اکثر چنین پیشرفتهایی ، خوش شانسی ، نقش مهمی را ایفا کرده است.
ورود پنی سیلین به دنیای پزشکی
پنی سیلین در فرم خالص آن ، حدود یک سال پس از کشف آن توسط الکساندر فلمینگ وارد دنیای پزشکی شده ، در دسترس عموم قرار گرفت. به دنبال آن پنی سیلینهای مختلفی با گروههای متفاوت سنتز گردید.
کپک فلمینگ که یک پنی سیلیوم- نوتاتوم میباشد، فقط چند واحد پنی سیلین در میلیلیتر محیط کشت تولید میگردد. پنی سیلین بوسیله گونههای مختلفی از پنی سیلیوم و آسپرژیلوس (جزء قارچها) تولید میشود. کشت پنی سیلیوم بمنظور تولید پنی سیلین ، نخست در سطر محیطهای کشت انجام میشد، ولی اکنون در درون یا عمق محیطهای کشت صورت میگیرد.
اسلاید 3 :
انواع پنی سیلینهایی که از نظر بالینی مهماند و در سطر صنعتی تولید میشوند
بالاترین فعالیت را بر علیه ارگانیسمهای گرم مثبت ، اسپروکتها و بعضی دیگر دارند. ولی نسبت به هیدرولیز بوسیله بتا لاکتاماز و نسبت به اسید ، حساس هستند. مثال: پنی سیلین G.
مقاومت نسبی به بتا لاکتاماز ولی دارای فعالیت کمتر بر علیه گرم منفیها مثال: نفیلیسین
فعالیت نسبتا زیادی بر علیه گرم مثبت ها و گرم منفیها ، ولی حساس به عمل بتا لاکتامازها مثال: آمپی سیلین ، پیراسیلن.
ثبات نسبی در برابر اسید معده و مناسب برای تجویز خوراکی مثل پنی سیلین V ، گلوکز اسیلن ، آموکسی سیلین.
پ ن: آنزیم بتالاکتاماز ، توسط برخی باکتری ها تولید می شودکه باعث تخریب حلقه ی بتا لاکتام شده .
که یکی از راههای دفاعی بر ضد داروها است وباعث بروز مقاومت مقابل برخی آنتی بیوتیکها می شود.
اسلاید 4 :
پنی سیلین ها از جمله مهمترین آنتی بیوتیک های بتالاکتام مورد استفاده در درمان عفونتهای میکروبی بوده وکاربرد وسیع آنها موجب پیدایش مقاومت نسبت به آنها شده است. جهت غلبه بر این نوع مقاومت امروزه تولید آنتی بیوتیک های نیمه سنتزی رایج گردیده و بالغ بر ۲۰ نوع پنى سیلین نیمه سنتزى به صورت تجارى تولید میشوند که آموکسی سیلین، آمپی سیلین، سفالکسین، سفازولین از جمله آنها میباشند. مشتقات نیمه سنتزی پنی سیلین علاوه بر داشتن خصوصیاتی هم چون پایداری بیشتر، جذب سریعتر و طیف اثر وسیعتر نسبت مشکل مقاومت باکتریایی را نیز V و G به پنی سیلین های در بسیاری از موارد حل کردهاند.
فعالیت پنی سیلین آسیلاز برای اولین بار توسط دانشمندان ژاپنی در سال 1950 توصیف شد .آنها دریافتند که میسلیوم Penicillium chrysogenum و Aspergillus oryzae می توانند بنزیلپنیسیلین را به فنیل استیک اسید و ترکیب دیگری تبدیل کنند ، که نویسندگان آن را "پنیسین" نامیدند و بعداً به عنوان اسیدaminopenicillanic (6-APA) شناخته شد.
در فرایند تولید پنى سیلین هاى نیمه سنتزى، پنى سیلین با یکى از دو روش شیمیایى یا آنزیمى پنى سیلین به ۶- آمینوپنیسیلانیک اسید ( APA -6 ) شکسته میشود، که این ماده حد واسط براى ساخت مشتقات دیگر، با روش شیمیایى مجدداً حلقوى میگردد.
از مزایاى تبدیل آنزیمى پنى سیلین به APA-6 میتوان به انباشته شدن کمتر مواد شیمیایى مضر در محیط، کارایى و سرعت بالاتر، امکان بازیابی و استفاده مجدد از آنزیم و هزینه پائین تر اشاره نمود.
در روش آنزیمى تبدیل پنى سیلین به APA -6 از پنى سیلین آسیلازها استفاده میشود. پنى سیلین G آسیلاز یک آنزیم مهم از نظر تجارى در صنعت داروسازى است که با هیدرولیز باند آمیدى در زنجیره جانبى پنى سیلین G موجب تولید فنیل استیک اسید paaو APA-6 میگردد. آنزیم پنى سیلین G آسیلاز بالغ و فعال در E. coli یک هترودایمر ۸۶ کیلودالتونى متشکل از دو زنجیره آلفا (α) و بتا (β) است که در کنار هم پیچیده شده و توسط نیروهای غیر کوالان به هم متصل میشوند.
AP
پنی سیلین g paa + apa-6
منابع و بومی سازی آسیلازهای پنی سیلین
اسلاید 5 :
پني سيلين آسيلاز ،آنزيمي كليدي است كه در توليد صنعتي آنتي بيوتيك هاي نيمه سنتتيك بتا لاكتام نقش دارد. اين آنزيم واكنش تبديلي پني سيلين G را به 6-APA و PAA از طريق هيدروليز زنجير آسيل جانبي كاتاليز مي كند.
اين آنزيم جهت هيدروليزپنی سیلین g به apa - 6 كه يك حدواسط مهم در توليد پنى سيلين هاى نيمه سنتزى بوده، استفاده مى شود.
APبه دليل اهميت اين آنزيم، تلاش هاى فراوانى جهت يافتن سويه هايى با بازده بالاى آنزيم انجام گرفته شده است.
آنزیم داخل سلولی است و باید توسط روشهای مکانیکی (سونیکیت ) و روشهای آنزیمی (حذف دیواره سلولی) آزاد شود. این آنزیم بر پنیسیلین G و پنیسیلین V اثر میگذارد و مادهای به نام 6APA تولید مینماید که از آن جهت ساخت آنتیبیوتیکهای نیمه سنتزی مانند آموکسیسیلین و آمپیسیلین استفاده میشود.
اسلاید 6 :
با توجه به نیاز صنایع آنتی بیوتیک سازی در جهان به آنزیم پنی سیلین g آسیلاز و لزوم انجام مطالعات مقدماتی تولید آن تصمیم به بهینه سازی تولید این آنزیم گردید.
پنی سیلین آسیلاز (PA ، به عنوان یک عامل کاتالیزور هیدرولیز پیوند آمید در آنتی بیوتیک های پنی سیلین کشف شد. این آنزیم متعلق به کلاس هیدرولازها ، زیر مجموعه ای از آمینوهیدرولازها است و گروهی از هیدرولازها را تشکیل می دهد.
PA بیش از 50 سال مورد مطالعه قرار گرفته است. در عمل ، از این آنزیم معمولاً برای تولید 6 آمینوپنی سیلانیک اسید استفاده می شود که سنتز اصلی در سنتز آنتی بیوتیک های پنی سیلین است.
PA در باکتریها ، مخمرها و قارچ ها یافت شده است. نقش فیزیولوژیکی آنزیم ضعیف درک نشده است. به نظر می رسد که کارکرد اصلی آن استفاده از ترکیبات هتروسیکلیک به عنوان منبع کربن باشد.
در حال حاضر ، پنی سیلین G اسیلاز حاصل از ecoliاز پر مصرف ترين آنزيم ها در صنعت داروسازى مي باشد
اسلاید 7 :
طبقه بندی پنی سیلین آسیلاز
پنی سیلین آسیلازها گروهی از β- لاکتام آسیلاز را تشکیل می دهند و می توانند با توجه به نوع بستر هیدرولیز بسته به نوع میکروارگانیسم ، آنزیم می تواند در بیرون یا داخل سلول ساکن شود طبقه بندی شوند. بنابراین ، آنزیم ها می توانند به عنوان آنهایی که هیدرولیز پنی سیلین G ، پنی سیلین V یا آمپی سیلین دارند ، گروه بندی شوند. در سال 1963 پیشنهاد شد كه پنی سیلین آسیلازها را به كلاسهای I و II تقسیم كنید .آنزیم های کلاس I اساساً هیدرولیز پنی سیلین V (فنوکسی متیلپنی سیلین) را تشکیل می دهند ، در حالی که آنزیم های کلاس II از پنی سیلین G (بنزیلپنیسیلین) به عنوان بستر استفاده می کنند. بعداً ، کلاس III ، شامل آنزیم هایی که آمپی سیلین هیدرولیز می کنند ، اضافه می شود.
اسلاید 8 :
ساختار اولیه PA-G
در حال حاضر ، بانکهای اطلاعاتی GeneBank ، EMBL حاوی توالی کامل نوکلئوتید و اسید آمینه از PA-GS از 40 موجودات هستند.. اولین ساختار 3D مولکول PA-G در سال 1995 برای یک PA از E. coli با وضوح 1.9 Å تعیین شد .
آنزیم فعال یک هترودیمر با جرم مولکولی 86 کیلو دالتون است. این شامل یک زیر واحد α کوچکتر (24 کیلو دالتون) و یک زیر واحد بزرگترB در N- پایانه (62 کیلو دالتون) است..
زنجیره های پلی پپتیدی دو زیر واحد یک ساختار هرمی مانند را با یک حفره کاسه عمیق در وسط تشکیل می دهند که سایت فعال در پایین آن واقع شده است.
از نظر ساختار ، گلوبول پروتئین را می توان به سه ناحیه تقسیم کرد - A ، B و C.
بعلاوه ، این مولكول حاوی یونی كلسیم Ca 2+ است كه برای پردازش آنزیم از اهمیت برخوردار است .
اصلاح پس از ترانسفکشن PA-G یک فرآیند چند مرحله ای است که به خوبی برای آنزیم E.coli مورد مطالعه قرار گرفته است. مرحله اول شامل انتقال پیشرونده غیرفعال از سیتوپلاسم به محفظه پیرپلاسمی ، فرایندی است که توسط پپتید سیگنال رانده می شود ، که پس از اتمام حمل و نقل برداشته می شود. پس از آن ، فضا بین زیرواحد تحت پروتئولیز دو مرحله ای قرار می گیرد ، که منجر به تشکیل یک هترودایمر فعال می شود .
اسلاید 9 :
مهندسی پروتئین PA-G
در گذشته ، رویکرد اصلی برای افزایش کارآیی فرایندهای صنعتی بهینه سازی شرایط در فرآیند بیوکاتالیستی بوده است. چنین بهینه سازی مبتنی بر پارامترهای جنبشی و خصوصیات فیزیکی و شیمیایی اجزای محیط واکنش بود. این روش موفقیت آمیز بود و به نتایج بسیار خوبی منجر شد. امروزه ، این رویکرد عملاً پتانسیل خود را خسته کرده است: طراحی واقعی آنزیم به طور فزاینده ای رایج می شود.
مطالعات پراش پرتو X بر روی PA ، جهش های آن ، و مجتمع هایی با بسترهای مختلف ، آینده ای برای درک رابطه ساختار-عملکرد و همچنین طراحی منطقی از سایت فعال فراهم کرده است. هدف از این طرح بهبود خصوصیات آنزیم است که می تواند باعث افزایش کارآیی سنتز آنتی بیوتیک ها با واسطه PA و جداسازی آنانتومرها شود.
به دلیل محدودیت های ترمودینامیکی ، سنتز آنتی بیوتیک ها نه در تراکم مستقیم بلکه در تعویض هسته ای استوار است.
در حال حاضر مهندسی پروتئین از طیف گسترده ای از رویکردها مبتنی بر معرفی جایگزینی اسیدهای آمینه مستقیم و تصادفی یا حتی قطعات زنجیره ای از پلی پپتید استفاده می کند. یکی از این رویکردها ، یعنی انعکاس DNA ، اکنون به طور فزاینده ای محبوبیت پیدا می کند و با موفقیت در تولید آنزیم های مهم صنعتی با خواص تقویت شده مورد استفاده قرار می گیرد. این روش مبتنی بر نوترکیب ژن های کدگذاری شده برای آنزیم های همولوگ از ارگانیسم های مختلف است ، که منجر به تولید پروتئین های کیمریک می شود که از قطعات آنزیم های اصلی تشکیل شده است.
اسلاید 10 :
بیان PA های نوترکیب در E. coli
بسته به اهداف مورد نظر ، کلونینگ و بیان آنزیم های نوترکیب در سیستم های مختلفی قابل انجام است. به عنوان مثال ، باکتری، مخمر، گیاهان، سلول های حشرات یا سیستم های عاری از سلول.از آنجا که PA-G فقط در باکتریها یافت می شود ، سیستم های بیان باکتری E. coli مناسب ترین برای تولید آنزیم نوترکیب محسوب می شوند.
انتخاب بردار پروموتر و بیان از نظر انتخاب یک وکتور بیان ، از پلاسمیدهای شماره با کپی بالا و کم استفاده شده است. از پروموترهای زیر برای کنترل بیان پروتئین استفاده شده است: lac ، tac ، trc ، T7 و araB. ژن PA-G از E. coli، Actinomyces viscosus، Providencia rettgeri، Kluyvera citrophila، Bacillus megaterium، و A. faecalis کلون شد.
هیچ ارتباطی قوی بین نوع پروموتر و عملکرد آنزیم فعال وجود ندارد. به عنوان یک قاعده ، مروج های قوی تر (به عنوان مثال مروج RNA- پلیمراز فاژ T7) سطح بالاتری از بیان را ارائه می دهند. با این حال ، در بسیاری موارد منجر به تاشو غیر طبیعی پروتئین و تجمع یک آنزیم نامحلول به عنوان اجسام به اصطلاح ورود به سیستم می شود. با استفاده از پروموتورهای کمتر قوی ، می توان عملکرد پروتئین محلول را افزایش داد. به طور کلی ، بیان هر آنزیم جداگانه نیاز به انتخاب یک بردار بهینه دارد.
اسلاید 11 :
عوامل موثر در کشت pa
عواملی که بر میزان بیان PA تأثیر می گذارند ، در رونویسی و ترجمه هستند و به مرحله محدود کردن به وکتور انتخاب شده و فشار میزبان بستگی دارد. با این وجود ، اکثر محققان پروموتورهای قوی مانند tac و T7 را انتخاب می کنند و از ایزوپروپیل-β-D-تیووگالاکتوزید (IPTG ) به عنوان القا کننده استفاده می شود. عملکرد پروتئین محلول محلول معمولاً از طریق بهینه سازی پارامترهای کشت افزایش می یابد.
بهينه سازي شرايط توليد آنزيم
در مرحله بهينه سازي يكي از سويه ها كه داري فعاليت آنزيم بیشتري بود انتخاب و اثر شرايط مختلف بر مقدار توليد آنزيم مورد بررسى قرار گرفت.به طور معمول در محیط مایع به مدت 24 ساعت در دماى 37 درجه سانتى
گراد انكوبه گرديدند. سپس مقدارى از باكترى ها به محيط كشت مايع توليد آنزيم شامل پپتون باكتريولوژيك( 5 در صد٪) عصاره گوشت( 3٪) و فنيل استيك اسيد( ٪15 تلقیح شدند. محيط ها به مدت 24 ساعت در 30 درجه سانتى گراد در انكوباتور با دور 150 rpmو پس از آن ميزان فعاليت آنزيمى سويه ها سنجيده شد
تأثیر دما
عملکرد PA فعال به شدت بستگی به دمای کشت دارد. آزمايشات بيان پروتئين در سه دماي مختلف: 22 ، 28 و 37 درجه سانتي گراد انجام شد. براي همه تركيبات پلاسميدها و سويه هاي ميزبان ، بيشترين عملكرد پروتئين بومي در 22 درجه سانتي گراد مشاهده شد. این تأثیر احتمالاً با این واقعیت توضیح داده شده است که ، در دمای پایین ، آنزیم با موفقیت در تمام مراحل اصلاح پس از ترانسفرانسالیال قرار گرفته و ترکیب بومی را بدست می آورد ، که منجر به افزایش عملکرد آنزیم فعال محلول می شود. افزایش دما باعث افزایش میزان سنتز پروتئین می شود. بنابراین ، آنزیم نامحلول در سیتوپلاسم جمع می شود.
اسلاید 12 :
بررسي تاثير زمان كشت باكتري
در اين مرحله ابتدا باكتري مورد نظر را در چهار لوله
48 و 72 ،24 ، مختلف كشت داده و محيط ها به ترتيب 18
انكوبه rpm دار در دور 150 shaker ساعت در انكوباتور
و پس از طي مدت زمان هاي تعيين شده ميزان توليد آنزيم
با روش كلريمتريك بررسي شد.
بررسي اثر غلظت هاي مختلف فنيل استيك اسيد
جهت انجام اين آزمايش باكتري مورد نظر درشش لوله
،0/15 ،0/1 ، آزمايش جداگانه كه حاوي غلظت هاي 0
0/25 گرم از فنيل استيك اسيد در محيط توليد بودند ،0/2
تلقيح گرديده و پس از انكوباسيون 24 ساعته در 28 درجه
ميزان توليد آنزيم با روش كلريمتريك بررسي شد.
بررسی اثر PH محيط كشت بر ميزان توليد آنزيم
جهت انجام اين آزمايش پنج محيط جداگانه مايع تهيه وph محيط ها قبل از
استريليزاسيون به ترتيب روي pH 5،6، 7، 8،9 تنظیم شدند. بعد از تلقیح
باکتری ها و انكوباسيون به مدت زمان تعيين شده ميزان توليد آنزيم با
روش كلريمتريك بررسي گرديد.
غربال و شناسايى سويه هاى توليد كننده آنزيم پنى سیلین G اسیلاز
با روشBioassay
يك روش ميكروبيولوژيكي و كيفي است كه اساس آن حساسيت
سويه مورد
6- و مقاومت آن به پنى سيلين مى باشد. در APAنظر به
صورت توليد آنزيم پني سيلين آسيلاز توسط سويه هاي
اشرشيا كولي مورد آزمايش و انتشار آن در محيط، آنزيم
6- و فنيل APA موجود به Gموجب شكستن پني سيلين
6- باعث مهار رشد سراشيا APA استيك اسيد شده و
مارسنس مى گردد. از ميان 121 نمونه اشرشيا كولي مورد
آزمايش تنها درمورد 3 ايزوله هاله عدم رشد سراشيا
مشاهده شد .اين عدم رشد به صورت هاله كاملاً مشخصي
بر روي كلني هاي اشريشيا كولي و در ميان پيگمان صورتي
سراشيا كه در نواحى رشد به طور يكنواختي منتشر شده
بود نمايان گرديد
اسلاید 13 :
تأثیر ترکیب متوسط و مواد افزودنی مختلف
یکی از مهمترین پارامترهای بیان PA حضور یون های کلسیم در محیط کشت است. Ca2 + هم برای رشد سلولی مهم است و هم برای تشکیل PA محلول فعال ، زیرا یونهای کلسیم در مولکولهای PA فعال وجود دارند.
Ca 2+ نقش مهمی در جابجایی پیشرو پروتئین در غشاء و همچنین در تاشو و بلوغ صحیح آنزیم در پریپلاسم دارد .
روش دیگر که باعث افزایش سطح PA محلول در سلول می شود ، اضافه کردن منابع کربن کم مولکولی به محیط است. نشان داده شده است که منابع کربن اضافی باعث افزایش زیست توده و همچنین کاهش تجمع پروتئین نامحلول در سلول می شوند .رایج ترین ترکیبات حاوی کربن کم مولکولی لاکتوز ، گلوکز ، آرابینوز و گلیسرول هستند.
مطالعات بیشماری نشان داده اند که ترکیب محیط کشت به شدت بر میزان بیان و عملکرد آنزیم فعال تأثیر می گذارد. بالاترین عملکرد PA-G فعال هنگامی حاصل می شود که گلوکز به عنوان منبع کربن استفاده شود.
افزودن گلیسرول باعث کاهش سطح پروتئین نامحلول در پریپلاسم می شود. برخی از نویسندگان گلیسرول را نه تنها یک منبع کربن بلکه یک "صابون شیمیایی" می دانند که پروتئین و بلوغ پروتئین را تسهیل می کند.
اسلاید 15 :
تولید صنعتی پنی سیلین
مرحله اول
با عمل تخمیر پنی سیلیوم کریزوژنوم شروع میشود که دارای شرایط زیر است:
تخمیر در یک حجم تا 100 متر مکعب صورت پذیرد.
PH در حدود 6,5 باشد.
شرایط استریل رعایت گردد.
کنترل دمایی و PH صورت پذیرد.
زمان تخمیر ، 8-6 روز میباشد.
سوبستراهای استفاده شده به عنوان غذا عبارتند از: منبع کربنی (معمولا گلوکز) ، منبع نیتروژنی ، لاکتوز، آمینو اسید ، نمکهای معدنی.
مرحله دوم
فیلتروکریستاله کردن پنی سیلین G (پر مصرفترین پنی سیلین طبیعی که از تخمیر پنی سیلیوم بدست آمده و منشاء ساخت انواع دیگر پنی سیلینها میباشد.
مرحله سوم
با انجام فرایندهای آنزیمی و شیمیایی ، آن را به 6 - آمینوپنیسیلینیک اسید تبدیل میکنند. رادیکال اسیدی که به گروه آمینو متصل است، میتواند بوسیله اسید از باکتریها یا آمیدازهای دیگر جدا شود. تمامیت ساختمانی هسته 6 - آمینوپنی سیلانیک اسید برای فعالیت بیولوژیک پنی سیلینها ضروری است. اگر حلقه بتا لاکتام توسط بتا لاکتاز (پنی سیلیناز) شکسته شود، ماده حاصله پنی سیلوئیک اسید خواهد بود که فاقد فعالیت ضد میکروبی است.
با اینحال این مولکول ، یک شاخص آنتی ژنیک پنی سیلینها را حمل میکند و میتواند اگر به یک پروتئین حمل کننده بچسبد، به عنوان یک هاپتن حساسیتزا عمل کند. رادیکالهای (R یا گروه جانبی) مختلفی که به اسید آمینو پنی سیلانیک میچسبند، خواص فارماکولوژیک داروی حاصله را مشخص میکنند.
مرحله چهارم
با فرایندهای آنزیمی و شیمیایی بیشتر ، به انواع پنی سیلین تبدیل میکنند: مثلا آمپی سیلین ( آلفا - آمینو بنزیل پنی سیلین ) که شبیه پنی سیلین G بوده، چرا که توسط بتا - لاکتاماز تخریب میشود، اما در برابر اسید پایدار میباشد. فعالیت بیشتری در برابر باکتریهای گرم منفی دارد
اسلاید 16 :
تکنولوژی و روشهای تولید
برای تولید آنزیم صنعتی در مقیاس تجاری در ایران روش انتخاب بهترین سویه میکروارگانیسم هنوز ارجحیت دارد. به علت تنوع آنزیم ها بحث درباره این میکروارگانیزم ها و شرایط کشت آنها از حیطه این نوشتار خارج است.
1) کشت اولیه باکتری در پلیت :
برای تکثیر سویه ایزوله شده باکتری آن را در محیط آماده شده روی پلیت کشت می دهیم تا هم تعداد بیشتری از باکتری داشته باشیم و هم بتوانیم آن را کنترل کنیم.
2) کشت باکتری در فلاسک:
برای افزایش ظرفیت کشت بایستی باکتری را در مرحله بعد در ارلن کشت داد تا ظرفیت آن به حدود 3/75 لیتر برسد این کار برای تهیه مقدار محیط قابل تلقیح به فرمانتور اول انجام می شود. مقدار ظرفیت در این مرحله بستگی به ظرفیت فرمانتور مرحله اول دارد. در این مرحله با توجه به میزان محیط کشت می توان جهت کاهش هزینه آنرا در چند ارلن در شرایط استریل به فرمانتور انتقال داد.
3)کشت باکتری در فرمانتور و تولید آنزیم:شکل مقابل
برای افزایش مقدار آنزیم بایستی محصول بدست آمده از ارلن را در شرایط تعریف شده و با غلظت مناسب به فرمانتور انتقال داد. این کار برای افزایش حجم بیشتر و در نهایت بدست آوردن محصول بیشتر انجام می گیرد. عملیات فرمانتاسیون در دو مرحله و با ظرفیت های متفاوت انجام می گیرد.
4)جداسازی باکتری از سوپر ناتانت:
محصول فرمانتور نهایی شامل سوپر ناتانت و باکتری می باشد که برای جدا سازی نیاز به اجرای دو مرحله سانتریفیوژ کردن و فیلتر کردن دارد. در مرحله اول جداسازی از سانتریفیوژ استفاده شده و آنزيم صنعتی بدست آمده برای جدا سازی صمغ آن به فیلترها هدایت می شوند. در این بخش به جای سانتریفیوژ پیوسته می توان از فیلتر پرس نیز استفاده نمود.
اسلاید 17 :
5) فیلتراسیون:
محصول بدست آمده از سانتریفیوژ و یا فیلتر پرس را به فیلترهای مخصوص (اولترا فیلتر) هدایت کرده و توسط این سیستم آنزیم را جدا می کنند.
6) خشک کردن:
آنزيم های صنعتی به دست آمده بایستی به طریق مناسب و علمی خشک شود. به این منظور می توان از خشک کن های مناسب استفاده نمود.
7) آسیاب کردن:
ماده خشک شده را برای تهیه پودر محصول بایستی آسیاب کرد.
8) گرانوله کردن:
پودر به دست آمده از مرحله قبل را وارد دستگاه مخصوص تهیه گرانول نموده و افزودنی های مناسب به آن اضافه می شود که در نهایت خروجی آن آنزیم گرانوله است.
9) کنترل کیفی:
در این مرحله محصولات تولیدی مورد عملیات کنترل کیفی قرار می گیرند و در صورت تائید آنها روانه ایستگاه بسته بندی می شوند.
10 ) بسته بندی:
در مرحله آخر فرآیند تولید عملیات بسته بندی انجام می شود.
11) انبارش:
آنزیم های صنعتی بسته بندی شده ، در انبار نگهداری می شود تا مطابق سفارش رسیده به واحد تولید به بازار مصرف ارسال گردد. در صورتی که بخواهیم محصول فرمانتور را به صورت مایع به بازار عرضه نماییم نیازی به مراحل 6 الی 8 نمی باشد.
اسلاید 18 :
نتیجه گیری
امروزه آنتی بیوتیکها کاربرد وسیعی در درمان عفونتهای میکروبی مختلف دارند ولی نباید از نقش سیستم ایمنی ذاتی نیز در مقابله با عفونتها غافل شد.
برخی مطالعات انجام شده در انسان و حیوانات حاکی از وجود آثار سوء آنتی بیوتیکها بر فعالیت نوتروفیلهاست. نوتروفیلها اولین خط دفاعی سلولی در سیستم ایمنی ذاتی میباشند. بنابراین آثار سوء آنتی بیوتیکها بر فعالیت و عملکرد نوتروفیلها نباید نادیده گرفته شود. بدیهی است آنتی بیوتیکی که واجد بهترین اثر ضدمیکروبی و همزمان دارای کمترین اثر سوء جانبی بر فعالیت نوتروفیلها و سلولهای دیگر موجود زنده باشد، میتواند به عنوان آنتی بیوتیک انتخابی، پیشنهاد شود. به عبارت دیگر به منظور اخذ راهبرد درمانی مناسب نه تنها به اثر ضدمیکروبی آنتی بیوتیکها بایستی توجه کرد، بلکه با دیدی جامع همه آثار مثبت و منفی آنتی بیوتیک مورد استفاده را مد نظر قرار داد و بر اساس تحلیل فایده و زیان، اقدام به پیشنهاد استفاده یا عدم استفاده از یک آنتی بیوتیک خاص نمود.
اگرچه حیوانات دارای توان فوق العاده ای در برخورد مؤثر با هجوم باکتریها هستند و در بیشتر موارد عفونتها فاقد علایم بالینی است ولی گاه عفونت به حدی شدید است که نیاز به درمان آنتی بیوتیکی دارد. پنی سیلین ها، تتراسایکلین ها و فلوروکینولون ها از متداولترین داروهای ضدمیکروبی در دامپزشکی هستند. مطالعات حاکی از وجود عوارض گسترده سمی این داروها در بدن میزبان است و مطالعات فراوانی در این خصوص انجام گرفته است. ولی اثر آنها بر فعالیت نوتروفیل های خون محیطی مشخص نیست.
امروزه سعی بر این است تا با تکنولوژی DNA نو ترکیب بتوانند پنی سیلین را در سطح صنعتی و بصورت وسیع تولید کنند. در این صورت میکرو ارگانیسم تولید کننده پنی سیلین ، تنها محدود به قارچها نخواهد بود.
اسلاید 19 :
با وجود حجم زیاد کار در زمینه مهندسی پنی سیلین آسیلازها ، مشکل تغییر خصوصیات کاتالیزوری و ثبات PA ها به دور از حل نیست. این امید است که جداسازی و بررسی پسیلسیلین آکیلازها از منابع دیگر می تواند اصول اساسی رابطه "ساختار-عملکرد" را در این آنزیم نشان دهد.
اين آنزيم يكي از مهم ترين كاتاليست ها در صنعت توليد آنتي بيوتيك ها بوده ومحققين متعددي به
طور مستقل هيدروليز پني سيلين هاي مختلف را توسط پني آسيلاز حاصل از ميكروارگانيزم هاي مختلف پنی سيلين شرح داده اند . در سال هاى اخير پژوهش هاى فراوانى درمورد غربال گرى و بهينه سازى سويه هاى توليد كننده اين آنزيم صورت گرفته كه هدف آن ها يافتن سويه هايى با بازده بالاتر و بهبود شرايط توليد در مقياس صنعتى بوده است.
