پاورپوینت کنترل کیفی آزمایشگاه میکروب شناسی

بخشی از پاورپوینت

اسلاید 2 :

موضوع :
كنترل كيفي آزمايشگاه ميكروب شناسي

اسلاید 3 :

تهيه و کنترل کیفیت محیط های کشت
نکات عمومی در مورد محیط های کشت:

آب:

کیفیت محیط های کشت بطور مستقیم بستگی به کیفیت مواد خام مورد استفاده در تهیه آنها دارد. آب یکی از مهمترین موادی است که در تهیه محیط های کشت بکار میرود. سه معیار مهم برای آب مورد استفاده در تهیه محیط های كشت شامل وجود یونهای مس، قدرت هدایت الکتریکی و pH می باشد. در شرایط ایده آل یونهای مس بدليل خاصیت مهارکنندگی برای اغلب میکروارگانیسم ها نباید در آب مورد استفاده جهت تهیه محیط های کشت وجود داشته باشد. قدرت هدایت الکتریکی آب باید کمتر از 15 میکرو زیمنس باشد وهمچنینpH آب مورد استفاده بهتر است کمی اسیدی باشد ولی نباید کمتر از 5/5 باشد.

اسلاید 4 :

توزين محيط کشت و افزودن آب:

طبق دستورالعمل تهيه محيط کشت که بر روي قوطي نصب گرديده است، مقدار مناسبي از پودر محيط کشت را با دقت وزن نماييد. ظرف محيط کشت را دور از کوران هوا و رطوبت باز کنيد. از استنشاق پودرها به خصوص آنهايي که داراي مواد سمي هستند و تماس طولاني مدت آنها با پوست اجتناب کنيد. پودر را به سرعت، به دقت و بدون ايجاد توده اي از غبار وزن کنيد. هرچه زودتر درب ظرف را ببنديد.

نصف حجم آب مورد نياز را داخل ظرف بريزيد. سپس مقدار وزن شده محيط کشت را به آن اضافه نماييد. براي چند دقيقه به تندي تکان دهيد. باقيمانده آب را به ديواره ظرف بريزيد تا ذرات محيط کشت چسبيده به ديواره نيز وارد محلول شوند. اين مرحله بسيار مهم است، چون پودر خشک محيط کشت در بالاي سطح آب، ممکن است در اتوکلاو استريل نشود و منبع آلودگي گردد.

اسلاید 5 :

حل کردن محيط کشت:

محيط هاي کشت بدون آگار، معمولا با تکان دادن آهسته و ملايم حل خواهند شد. اما محيط هاي کشت حاوي آگار بايد قبل از حرارت دادن به مدت چند دقيقه با آب مخلوط شوند. سپس حرارت داده شوند تا آگار قبل از اتوکلاو کردن، حل شود. محيط هاي کشت را بجوشانيد بدون آنکه بسوزند.

محيط هاي کشتي که نبايد اتوکلاو شوند، بعد از اين مقدار حرارت دادن، براي تقسيم داخل پليت ها يا ظروف ديگر آماده خواهند بود. اکثر محيط هاي کشت به استريليزاسيون نهايي (در دماي C °121 به مدت 15 دقيقه) نياز خواهند داشت.

اسلاید 6 :

اندازه گيري و تنظيم pH:

محيط هاي کشت دهيدراته اگر بطور مناسب تهيه شوند نيازي به تنظيم pH ندارند.pH نهايي محصول استريل شده را مي توان روي پليت يا بطري اندازه گيري کرد، اما بايد آنها را بعد از سنجش pH دور ريخت. بنابراين بعد از استريل شدن و خنک شدن محيط کشت تا دماي C °25، مقدار pHرا در حد مورد نظر (2/0 ±) تنظيم نماييد. تنظيم pH معمولا با استفاده از هيدروکسيد سديم 40 گرم در ليتر (تقريبا" يک مولار) و يا با استفاده از اسيد کلريدريک 5/36 گرم در ليتر (تقريبا" يک مولار) انجام مي شود.

اسلاید 7 :

توزيع:
محيط کشت را در ظرفي مناسب با حجم 2 تا 3 برابر حجم محيط کشت بريزيد تا بتوانيد آنرا به خوبي تکان دهيد و مخلوط کنيد.

اسلاید 8 :

استريليزاسيون:
بعضي از محيط هاي کشت به استريليزاسيون با اتوکلاو احتياجي نداشته و با جوشاندن استريل مي شوند که دستور ساخت آنها بر روي برچسب قوطي محيط کشت قيد گرديده است. استريليزاسيون ساير محيط هاي کشت توسط حرارت مرطوب يا صافي غشايي انجام مي گردد که اين موارد نيز بر روي بر چسب قوطي محيط کشت قيد گرديده است.

اسلاید 9 :

الف) استريليزاسيون با حرارت مرطوب:
استريليزاسيون محيط کشت تا حجم يک ليتر، در اتوکلاو به مدت 15 دقيقه و در دماي C °121 (فشار 2/1 کيلوگرم بر سانتيمترمربع) انجام مي گيرد. براي حجم هاي بيشتر از يک ليتر بايد چرخه استريليزاسيون را بطور مناسب تغيير داد. اما چون اکثر مشکلات در استريليزاسيون محيط هاي کشت وقتي رخ ميدهد که مقادير بيشتر از دو ليتر محيط کشت بايد استريل شود، لذا توصيه مي شود که مقادير زياد محيط کشت را در حجم هاي کوچکتر تقسيم نماييد.

اسلاید 10 :

کنترلی کیفی اتوکلاو
کنترل دما و فشار اتوکلاو بایستی بطور مداوم انجام گردد. برای کنترل اتوکلاو از اندیکاتورهای شیمیائی TST استفاده می کنند. از اندیکاتورهای بیولوژیکی که جهت کنترل کارائی اتوکلاو استفاده می کنند اسپور Bacillus Stearothermophilus را می توان نام برد که بصورت تجاری قابل دسترس می باشد.

اسلاید 11 :

ب) استريليزاسيون با صافي غشايي:
از صافي غشايي براي استريل کردن محيط هاي کشت و ترکيبات حساس به حرارت استفاده مي شود. استريليزاسيون بوسيله صافي غشايي تحت شرايط خلاء يا افزايش فشار انجام مي پذيرد. از غشاء ها و صافيهاي با قطر منفذ 22/0 يا 45/0 ميکرومتر استفاده نماييد. اين فيلترها بايد قبل از استفاده، در اتوکلاو استريل شوند. در مورد غشاء ها و صافيهايي که در بسته بنديهاي استريل به فروش مي رسند، به دستورالعمل سازنده مراجعه نماييد. قسمت هاي مختلف دستگاه صافي را با صافي يا بدون صافي در اتوکلاو به مدت 15 دقيقه در دماي C °121 استريل نماييد.

اسلاید 12 :

آماده سازي جهت مصرف:
بعد از استريليزاسيون، اجازه دهيد دماي محيط کشت به حدود C °50 برسد، سپس با رعايت شرايط آسپتيک در ظروف نهايي تقسيم نماييد. هيچ وقت محيط کشت را در دماي بالاتر از C °50 تقسيم نکنيد. مکمل هاي حساس به گرما و حرارت بايد بعد از اين که دماي محيط کشت به حدود C °50 رسيد، به آن اضافه شوند. اجازه دهيد دماي مکمل (ساپلمنت) استريل قبل از اين که به محيط کشت اضافه شود، به دماي اتاق برسد. سپس مکمل را با رعايت شرايط آسپتيک به محيط کشت اضافه نموده، خوب مخلوط کنيد و در ظروف نهايي که از قبل استريل شده اند، تقسيم نماييد.

اسلاید 13 :

پتری دیش:
کیفیت پتری دیش های مورد استفاده در تهیه محیط نیز اهمیت دارد. معمولاً پتری دیش ها را را با اتیلن اکساید ویا اشعه گاما استریل می کنند. در صورت استفاده از پتری دیش هایی که با اتیلن اکساید استریل شده باشند بایستی از نظر وجود بقاياي این ماده بررسی شود زیرا اتیلن اکساید دارای خاصیت مهار کنندگی برای میکروارگانیسم ها می باشد و می توان آن را با روش کروماتوگرافی اندازه گرفت. در صورت استفاده از پتری دیش های شیشه ای بایستی از پتری دیش هایي از جنس بروسيلیکات استفاده کرد. استفاده از پتری دیش هایي از جنس قلیائی ممکن است موجب آزاد سازی قلیا در داخل محیط کشت گردد.

اسلاید 14 :

پارامترهای فیزیکی:
محیط کشت های تهیه شده باید قبل از استفاده، از لحاظ فیزیکی و ظاهری نيز بررسی شوند. معیارهای ظاهری قابل بررسی شامل وجود حباب، حفره، ناصافی سطح محیط، ترک خوردگی، یخ زدگی می باشد. ضخامت محیط نیز اهمیت دارد. ضخامت محیط های کشت پلیتی نبايد كمتر از 3 میلی متر باشد.

اسلاید 15 :

روش تهيه برخي محيط هاي كشتروش تهیه محیط کشت ژلاتین (ترکیبی)
پیتون= g5
Beef Extract = g 3
ژلاتین= g 120
مقادیر فوق را به cc1000 آب مقطر اضافه کرده و در بن ماری جوش قرار دهید تا کاملاً حل شوند (از حرارت دادن این محیط کشت بر روی شعله پرهیز کنید). سپس در اتوکلاو به مدت 15 دقیقه و دمای oC121 در فشار 15 پوند ( Lb15) استریل نمایید. سپس در لوله تقسیم کرده و PH محیط کشت را به 8/6 برسانید

اسلاید 16 :

روش تهیه محیط کشت آب پپتونه قلیایی یا APW (ترکیبی)
پیتون= g10
کلرور سدیم (Nacl)= g10
آبمقطر=cc 1000
سپس pH را به 9-6/8 برسانید و در شرایط 15 دقیقه, فشار Lb 15 در اتوکلاو قرار داده و استریل نمایید. دما نیز oC121 است. ( برای تنظیم از سودN 1 استفاده کنید)

اسلاید 17 :

روش تهیه محیط کشت NaCl5/6% (براث/ آگار)
محیط پایه همان محیط برین هارت اینفیوژن براث/آگار است. از آنجا که این محیط کشت حاوی 5/0% نمک میباشد، بنابراین 6% نمک به این محیط پایه اضافه نمایید تا مقدار 5/6% نمک حاصل شود. شرایط استریلیزاسیون همان دمایoC121، فشار Lb15 و زمان 15 دقیقه میباشد.
براساس دستور ساختی که روی هر بسته محیط کشت قید شده پودر بلادآگار را وزن نموده و در مقدار مشخص آب مقطر بریزید پس از حرارت دادن و ذوب کامل پودر آن را در 121 درجه سانتیگراد برای 15 دقیقه اتوکلاو نمایئد پس از خروج از اتوکلاو و سردشدن تا دمای 500C تا 550C حدود 10 درصد خون گوسفند اضافه نماید و پس از مخلوط کردن به آرامی داخل پتری دیش ازمایشگاهی تقسیم کنید. و بگذارید سرد شود. اگر قصد ساختن آگار شکلاتی ChoColate Ajar را دارید پس از افزودن خون به بلاد آگار آن را در دمای 75 تا 80 درجه قرار دهید تا محیط آگار شکلاتی داشته باشید.

اسلاید 18 :

Mueller Hinton Agar محیط مولر هینتون آگار
این محیط کشت در اصل برای جداسازی گونه نیسریابی بیماری زا فرموله شد. امروزه بیشتر در ارتباط با دیسکهای آنتی بیوتیکی با توان بالا برای تعیین الگوهای حساسیت آنتی بیوتیکی بکار میرود. روش ساخت آن بسیار ساده است پس از وزن مقدار مشخص از پودر آن را در آب مقطر استریل و در روی شعله حرارت داده تا پودر کاملاً حل شود سپس در اتوکلاو 121 درجه سانتیگراد برای 15 دقیقه استریل نمایئد پس از خروج از اتوکلاو و سرد شدن تا 50 درجه سانتیگراد آن را در ظروف پتری دیش تقسیم کنید ضخامت محیط کشت از چهار میلیمتر بیشتر نگردد.

اسلاید 19 :

محیط Macconkey Agar
این محیط برای کشت انتروباکتریاسه مفید است و محتوی نمک صفراوی است تا باکتریهای غیر رودهای را مهار کند و نیز برای تشخیص کلی فرمهای تخمیر کننده لاکتوز از سالمونلاهای غیر تخیمرکننده لاکتوز و گروه دیسانتری، حاوی لاکتوز یا قرمز خنثی (Neutra red )است.

اسلاید 20 :

Bismuth Sulfite Ajar
بیسموت سولفیت آگار مناسب برای جداسازی سالموفلاتایفی و دیگر بایسلهای رودهای است روش ساخت آن مطابق دستور الصاقی روی ظرف میحط کشت است. بیسموت سولفیت آگار یک محیط کاملاً مغذی به علت وجود پپتونها، عصاره گوشت گاو و دکستروز است. سولفات فروز، معرف تولید سولفیدهیدروژن است بیسموت فلز سنگینی است که خاصیت مهار کنندگی بعضی از میکرو ارگانیسمها را دارد رنگ بریلیانت گرین نیز به عنوان مهار کننده است حضور این مهار کنندهها باعث مهار باکتریهای گرم مثبت و بیشتر ارگانیسمهای گرم منفی رودهای به جز اکثر گونههای سالمونلا و بعضی از گونههای شیگلا میشود. ممکن است گونه سالمونلا براساس ظاهر و رنگ کلونی احتمالی شنساسایی گردد. رنگ سیاه یا سبز ایجاد شده، یک رسوب فلزی است که وقتی سولفید هیدروژن (که توسط سالمونلا از ترکیبات سولفور در میحط ایجاد شده) با یک نمک آهن واکنش بدهد، تولید میشود. به طور شاخص کلونی ها سیاه یا سبز هستند و ممکن است با هاله سیاه یا قهوهای تیره با درخشندگی فلزی سبز احاطه شده باشند.