بخشی از مقاله
چکیده
با توجه به اهمیّت نانو ذرات در دنیای امروز و تاثیر آن ها بر گیاهان، این تحقیق به مطالعه اثر نانو ذرات اکسید روی بر میزان آنزیم های گایاکول پراکسیداز،پلی فنل اکسیداز، دهیدروژناز و مالون دی آلدئید در گیاه گلرنگ تحـت تـاثیر غلظـت هـای(0، 10، 100، 500، 1000 میلی گرم بر لیتر) در چهار تکرار و در شرایط گلخانه ای و آزمایشگاهی می پردازد. نتایج آنالیز داده ها نشان داد که با غلظت های مختلف نانو ذرات اکسید روی، آنزیم مالون دی آلدئید افزایش یافت. آنزیم گایاکول پراکسـیداز در غلظـت 100 میلـی گرم بر لیتر و پلی فنل اکسیداز در غلظت 10 و 500 و دهیدروژناز در1000 میلی گرم برلیتر نانو ذرات اکسید روی افـزایش نشـان دادند و در تیمارهای دیگر کاهش یافتند. این یافته ها علاوه بر نشان دادن تاثیر نانو ذرات در گیاهان، غلظت های مفید نـانو ذرات که تاثیر مثبت بر میزان آنزیم های گیاهان دارند را مشخص می کنند.
واژه کلیدی: نانو ذره، مالون دی آلدئید، گایاکول پر اکسیداز، پلی فنل اکسیداز، دهیدروژناز
مقدمه
نانو فناوری دانش وفنی است که توانایی تولید مواد، ابزار وسیستم های نوین را با دست کاری در سطح اتمی و مولکولی دارد و این پتانسیل را دارد که انقلابی در زمینه کشاورزی ایجاد کند. خواص نانو ذرات و افزایش استفاده از آنها و همچنین اثرات مضر آنها در محیط زیست باعث ایجاد نگرانی شده است(.(Chang et al., 2012 اکثر مطالعات در مورد اثرات نانو ذرات در سیستم های آبی بوده است . نانو ذرات از طریق گیاهان وارد زنجیره ی غذایی می شوند، هرچند سطح این نانو ذرات در حال حاضر قابل توجه نیست اما روزی می تواند به مرحله ی بحرانی برسد. بعضی از اهداف فناوری نانو ذرات بیماری شناسی گیاهی، مشکلات خاص کشاورزی در رابطه با پاتوژن ها،تعامل وایجاد راههای جدید برای حفاظت از محصول است(.(Guadalupe et al,2013 نانو ذرات در بسیاری از بخش های کشاورزی و زیست پزشکی استفاده می شوند .(Nairet al.,2010) همپنین نانو ذرات در برنامه های زیستی مختلفی شامل ژن و دارو، سنجش زیستی، تشخیصی و مهندسی، مورفولوژی سلولی، رفتارسلولهای بیماری زا و از بین بردن عوامل بیماری زا استفاده می شود (Soppimath et al.,2012)
فناوری نانو به عنوان علم کار کردن با کوچکترین ذرات باعث افزایش امید ها جهت غلبه نمـودن بـر معضـلات پـیش روی بخـش کشاورزی در آینده گردیده است. اثر گذاری چشم گیر فناوری نانو در عرصه های مهم بخش کشاورزی نظیـر اصـلاح ارقـام زراعـی جدید ، توسعه سیستم های هوشمند رسانش مواد شیمیایی و آفت کش ها ، تلفیق سیستم های هوشـمند بـه منظـور فـر آوری و بسته بندی مواد غذایی، زدودن بقایای علف کش ها از گیاهان و خاک وغیره حائز اهمیت است .(Moraru et al, 2003)
گلرنگ با نام علمی Carthamus tinctorius L. از تیره Compositae است .گـل آذیـن خوشـه ای گلرنـگ از نـوع کپـه ای متراکم می باشدکه به وسیله یک عدد گوشوارک پوششی (involucre)، پوشیده شده اسـت(زرگری،1368 و بـیگم فقیـر،.(1380 کشت گلرنگ در ابتدا به منظور استخراج رنگ از گلبرگ های آن جهت رنگ آمیزی پارچه و تزئین غذا انجام می گرفته ولی امـروز این گیاه برای تولید روغن،کنجاله،مواد دارویی، لوازم آرایشی و زینتی نیز کشت می شود .((Chao and Tae, 2000)
مواد و روش ها
جهت کاشت بذر گلرنگ با رقم برآن اصفهان که از شرکت پاکان اصفهان تهیه شده بود از خاک حاصلخیز با نسـبت50:50 خـاک و ماسه استفاده شد. از هر تیمار 4 گلدان و درون هر کدام 15 بذر در عمق 2cm کاشته شد. مراحل انجام کار در گلخانه و آزمایشگاه دانشکده علوم دانشگاه آزاد مشهد انجام شد. دمای گلخانه 25 درجه سانتیگراد و روزی یک نوبـت بـا آب شـهری آبیـاری شـد. در مرحله دو برگی گیاه، اولین اسپری برگی نانو ذرات اکسـید روی بـا غلظـت هـای(0، 10، 100، 500، (1000 داده شـد . دومـین و سومین اسپری با فاصله چهارده روز انجام شد و در مرحله آخر گیاهان برای انجام آزمایش خارج شدند.
سنجش فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز
استخراج عصاره آنزیم
به منظور اندازه گیری میزان فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز نیاز به تهیه محلول حاوی عصاره آنزیمی بود. به این ترتیب که ابتـدا 0/1 گرم از بافت برگ گیاهچه پس از شستشو با آب مقطر با 1 میلی لیتر محلول کلرید پتاسیم 0/8 مولار ( افزودن 0/6 گرم کلرید پتاسیم جامد به 10 میلی لیتر محلول بافر فسفات 0/1 مولار با (pH 6.8 در هاون چینی ساییده و مخلوط حاصل با سرعت 7000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه با استفاده از سانتریفیوژ سرمایشی ( Vision مدل (VS-15000 CFN، سانتریفیوژ گردیـد. بـه
منظور حفظ فعالیت آنزیم کلیه مراحل کار در ظرف یخ (1± انجام گرفت .(Mae-Adam and Nelson, 1992)
اندازه گیری فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز
به منظور اندازه گیری فعالیت آنزیم به عصاره آنزیم 3 میلی لیتر محلول بافر فسفات 0.1 مولار و 50 میکرولیتر گایـاکول و سـپس 50 میکرولیتر هیدروژن پراکسید % 3 اضـافه شـد و بلافاصـله تغییـرات جـذب نـوری در طـول مـوج 436 نـانومتر بـا اسـتفاده از اسپکتروفتومتر ( شیمادوز مدل (UV/110 در فواصـل زمینـی 15 ثانیـه بـه مـدت 3 دقیقـه ثبـت گردیـد ( Mae -Adam and
.(Nelson, 1992
اندازه گیری فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز
به منظور حفظ فعالیت آنزیم کلیه مراحل استخراج آنزیم در ظرف یخ (1± انجام گردیـد. انـدازه گیـری فعالیـت پلـی فنـول
اکسیداز به روش (Raymond et al., 1993)انجام گرفت. به این ترتیب که ابتدا، لوله ها در حمام آب 40 درجـه سـانتی گـراد قرار داده شدند و سپس به ترتیب به هر لوله 2/5 میلی لیتر محلول بافر فسفات 0/2 مولار با 0/2 , pH6.8 میلـی لیتـر پیروگالـل %99 اضافه گردید و به آن ها فرصت داده شد تا به دمای 40 درجه سانتی گراد برسند. در لحظه خواندن جذب آنزیم بـه هـر لولـه
2 میلی لیتر عصاره آنزیمی اضافه کرده و تغییرات جذب پلی فنول اکسیداز در فاصله زمانی 4 دقیقه، در طول موج 430 نانومتر، با استفاده از اسپکتروفتومتر ( شیمادوز مدل (UV/110 ثبت گردید .(Raymond et al., 1993)
اندازه گیری میزان مالون د آلدئید
2/0گرم از بافت برگ در 10 میلی لیتر تری کلرو استیک اسید 1/0 درصد (وزنی/حجمی) سائیده شده و در 10000 دور به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ شد. برای هر 1 میلی لیتر از محلول حاصل، 4 میلی لیتر %20 TCA حاوی تیوبوتیریک اسید % 5/0 اضافه گردید. سپس مخلوط حاصل در دمای 90 درجه به مدت 30 دقیقه قرار داده شد. نمونه ها به مدت 5 دقیقه در یـخ سـرد شـده و سـپس مجددا در 10000 دور به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شدند. جذب نمونه ها در طول موج 532 و 600 نانو متر توسط اسپکتروفتومتر خوانــده شــد. میــزان MDA از تفاضـــل مقــدار جــذب 600 از 532 و ضــرب کـــردن در 1.55×105 بدســت مــی آیـــد (واحد:.(Poonam et al., 2013) (µmol/gFW
