مقاله آپتامر؛ تولید ، کاربرد ، مزایا

بخشی از مقاله

آپتامر؛ تولید، کاربرد، مزایا

چکیده

در بیولوژی مدرن یک آپتامر یک الیگونوکلئوتید از DNA و یا RNA است که در خارج از محیط طبیعی یا در آزمایشگاه، برای باند شدن به یک مولکول هدف انتخاب میشود. از میان فرایندهایی که این مولکولها جدا میشوند انتخاب تکاملی از لیگاندها با غنیسازی نمایی یا SELEX می باشد. شروع آن با سنتز یک حوضچه از الیگونوکلئوتیدهای DNA شامل یک مناطقی از نوکلئوتیدهای راندوم است، که با توالی های محافظت شده که حاوی مناطقی برای باند شدن پرایمر برای استفاده در واکنش زنجیرهای پلیمرازی است. به بیان دیگر، آپتامرها را از کتابخانه های پیچیده اسیدنوکلوئیک سنتزی به کمک یکسری فرایند تکراری جذب و بازیافت و تکثیر دوباره جداسازی میکنند. آپتامرها کاربردهای بالقوه ای در وسائل آنالیز گر شامل بیوسنسورها و عوامل درمانی دارند. اندازه آنها بین 6 تا 40 کیلودالتون است و گاهی دارای ساختارهای سه بعدی ویژه و پیچیده هستند. آپتامرها می توانند انانیتومرهای ملکولهای کوچک و حتی تفاوت توالیهای ناچیز را به راحتی تشخیص دهند.

کلمات کلیدی: آپتامر، اسیدهای نوکلوئیک، روش سلکس، DNA، RNA

مقدمه

آپتامرها از واژه لاتین aptus به معنی متناسب3، مولکولهای اسید نوکلئیک 4 یا پپتیدی هستند که به مولکول هدف ویژه متصل میشوند. آپتامرها در زمینهی پژوهشهای پایه، اهداف کلینیکی به عنوان داروهای ماکرومولکولی، و صنعتی مورد استفاده قرار میگرفتهاند. آپتامرها برای استفاده در زمینهی بیوتکنولوژی پیشنهاد شدهاند این مولکول ها با توجه به توانایی مولکولی برای بازشناسی، قادرند با بیومولکولهای متداول یعنی آنتیبادیها رقابت کنند. لازم به ذکر است که، علاوه بر ویژگی بازشناسی این مولکولها، آپتامرها توانایی برتر، نسبت به آنتیبادیها دارند زیرا میتوانند آنها را در لولههای آزمایش به طور کامل طراحی نمود و با روشهای سنتز شیمیایی تولید نمود. از سوی دیگر، این مولکولها دارای ویژگیهای نگهداری مناسب هستند و در کاربردهای درمانی، کمتر و (یا فاقد آن) باعث تحریک سیستم ایمنی میشوند.[1]

-1 انواع آپتامرها

آپتامرها را میتوان به دو گروه زیر دستهبندی کرد: آپتامرهای 5RNA و یا 6DNA

آپتامرهای پپتیدی
-1-1آپتامرهای RNA و یا DNA

این آپتامرها لیگاندهای انتخابگر RNA و DNA تک رشتهای (به طور معمول) کوتاه اولیگونوکلئوتیدی هستند که به طور مصنوعی در آزمایشگاه ساخته میشوند. دستهای از آپتامرها همچنین در برخی از مولکولهای RNA ای طبیعی در موجودات زنده شناسایی شدهاند. برای مثال اینترون گروه I به طور اختصاصی به نوکلئوتید گوانین متصل میشوند. این RNAهای متصلشونده، نوعی آپتامر هستند. نوعی دیگر از آپتامرهای طبیعی عناصر تنظیمی ژنتیکی اسید نوکلئیوکی به نام سوئیچها 7 هستند که دارای ویژگیهای مولکولی بازشناساگر، شبیه به آپتامرهای مصنوعی میباشند. کشف این نوع توالیهای RNAای تنظیمی، اعتقاد به وجود (دنیای (RNA را در آغاز حیات بر روی کرهی زمین تقویت میکند. آپتامرهای اسید نوکلئیکی، طی چندین مرحله در شرایط In vitro8 با روش SELEX9 یا افزایش روشمند لیگاندها از طریق غنیسازی نمایی(تصاعدی) در آزمایشگاه طراحی میشوند. این آپتامرها قادرند به انواع مولکولهای متنوع همچون مولکولهای کوچک، پروتئینها، اسید های نوکلئویک و حتی سلولها،بافتهای موجودات زنده متصل شوند. ساختار لیگاندهای RNA و یا DNA با توالیهای تصادفی، امکان تولید مخلوطی از اولیگونوکلئوتیدهای با توالی بسیار مختلف را به وجود میآورد. برای مثال، مخلوطی از یک اولیگونوکلئوتید با طول 25 نوکلئوتید و داشتند حداقل 4 نوکلئوتید (4N)در هر جایگاه، پتانسیل ایجاد ترکیبی با 425 توالی (یا

(1025 دارد. از مخلوطهای اولیگونوکلئوتیدها، مولکولهای RNA میتواند به صورت شیمیایی با خواص ویژه انتخاب شوند که تمایل به اتصال به مولکولهای خاص کوچک را دارند. برای مثال میتوان RNA ای را که قادر به تشخیص تئوفیلین10 از کافئین است از یک جمعیت RNA ای تفکیک کرد2]، .[3

-2-1 آپتامرهای پپتیدی

این آپتامرهای پروتئینی از یک قلمرو متغیر کوتاه (با 10 تا 20 امینو اسید) تشکیل شده اند که در هر دو انتها، به یک داربست پروتئینی چسبیده هستند. در سلول، این آپتامرها قادرند با سایر برهم کنش های پروتئینی مداخله کنند.[4]

-2 تاریخچهی فرایند تولید

مرحله تولید آپتامر، سلکس (SELEX11) نام دارد که بر اساس سیستم اتصال تدریجی بنا نهاده شده است. سلکس (سیستم اتصال تدریجی بوسیله غنی سازی) به وسیله لاری گلد وگرایج ترک اختراع شده بود و بعد از آن پروفسور تد کواچ، روش فتوسلکس را توسعه داد. در سال 1989 وقتی که اتصال یک آنزیم ویروسی به یک توالی ویژه RNAشرح داده شد، آقایان گلد و ترک فهمیدند که میتوانند از رابطه بین پروتئین و نوکلئوتید یک کاربرد بسیار وسیع و مفید تعریف نمایند. آنها روشی را بنا نهادند که در آن بعضی اولیگونوکلئوتیدها که دارای طول 30 تا 40 باز بودند، قابلیت اتصال اختصاصی را به بعضی پروتئینها دارا میباشند، این روش گاهی In vitro evolution نام دارد. ایده استفاده از الیگونوکلئوتیدها در تشخیص بعضی مولکولها اولین بار در سال 1990 به وسیله آقایان الینگتون و سزوستاک مطرح شد و با پیشرفت علوم مولکولی و پایهگذاری تکنیک سلکس آپتامرهای اختصاصی برای بسیاری از مولکول ها جداسازی شد. این مولکولها شامل اسیدهای نوکلئیک، اسیدهای آمینه، قندها و پلیمرهای آنها و همچنین ترکیبات معدنی و مولکول های سطح سلولی میباشند.[5]

-3 فرایند تولید
برای هر لیگاند مورد نظر براحتی میتوان آپتامر ساخت. همانگونه که پیشتر آمد، برای این منظور از روشی بنام SELEX استفاده میشود. در این روش ابتدا بوسیله سنتز مصنوعی توالیهای بسیار مختلفی از RNA در اندازههای مختلف بصورت تصادفی ساخته میشود. در این مرحله بیش از یک میلیون نوع RNA ساخته میشود. هر یک از این مولکولهای RNA دارای ساختار فضایی خاصی است که در بین آنها یک یا چند مولکول RNA میتوانند بعنوان آپتامر به لیگاند مورد نظر متصل شوند. برای خالصسازی این آپتامرها از روش کروماتوگرافی میل ترکیبی12 استفاده میشود. در این روش ابتدا لیگاندها به دانههای سفادکس در ستون کروماتوگرافی متصل شده و سپس محلول حاوی انواع مولکولهای RNA سنتز شده از ستون عبور داده میشوند.آپتامرها به لیگاند متصل شده و در ستون باقی میمانند و بقیه مولکولهای RNA در اثر شستشو از ستون خارج میشوند.سپس مولکولهای آپتامر از ستون جداسازی میشوند. در این روش ممکن است چندین نوع آپتامر برای یک لیگاند بدست آید که هریک به قسمتی از لیگاند متصل میشود.پس از

انتخاب بهترین آپتامر، مولکول فوق تعیین توالی میشود و از روی آن توالی به روش سنتز مصنوعی، تعداد زیادی آپتامر ساخته میشود. همچنین میتوان از روی این آپتامرها cDNA ساخت و آن را به همراه یک پروموتر قوی در باکتریها کلون کرد. به این ترتیب باکتری مقدار زیادی آپتامر تولید خواهد کرد. به این آپتامرها، آپتامرهای منوکلونال گفته میشود2]، 3، .[6

-1-3 فرایند تولید یک لیگاند از اسیدهای نوکلئیک -1-1-3 سنتز کتابخانهها و پیچیدگیهای آن

شیمی ترکیبی13، عبارت است از تولید جمعیت زیادی از ملکولهای متفاوت با استفاده تکراری از فرایندهای محدود سنتزی ساده و مشخص. در این مورد فرایند سنتز فاز جامد اولیگونوکلئوتیدی صورت میگیرد. در فرایند ساخت تک رشته گروه عاملی خاص به وسیله یک محافظ protectator غیر فعال شده است با حذف protectonr فعال میشود. با ایجاد تغییراتی ساده (استفاده از ماسکهای مناسب) میتوان مرحله فعالسازی را برای گروههای عاملی فراوان انجام داد و به این طریق میتوان جمعیتی از اولیگونوکلئوتیدهای تصادفی بدست آورد. به این ترتیب که یک کتابخانه اسید نوکلئیک با طول چهل نوکلئوتید دارای تنوع حداکثر 440 میباشد (1/2 × 1024) این تعداد ترکیب مختلف را sequence space میگویند که میتواند با ایجاد تغییرات افزایش دیگر حتی چندین برابر شود (این تعداد هیچگاه سنتز نمیشود) .[7]

-2-1-3 انتخاب خصوصیت مورد نظر
توانائی مورد نظر، توانائی اتصال به ملکولی است که ما در نظر گرفتهایم و بسته به نوع کاربردی که مدنظر است این خصوصیت میتواند جذب سریع – جداشدن کند - گرایش بالا و یا گرایش پایین به ملکولهای خیلی مشابه و یا ترکیبی از موارد بالا باشد، اینگونه توانائیها14 میتوانند در اثر ساختمان سه بعدی اسید نوکلئیک مورد نظر ایجاد شوند و بطور مشخص ساختمان سه بعدی یک توالی اسید نوکلئیک را ترتیب بازهای آن را مشخص میکنند. به وسیله مخلوط کردن کتابخانه فاز محلول15، با ملکول هدف و جداسازی مجدد ملکول هدف (حذف اولیگوهائی که یا متصل شده اند و یا ضعیف متصل شده اند) میتوان اولیگونوکلئوتیدهای دارای خصوصیت مورد نظر را جداسازی نمود. (این مرحله بیشتر شبیه به ( affinity
(chromatography است.) .[7]
-3-1-3 کدگذاری ژنتیکی16

چون آپتامر مورد نظر توالی از ملکولهای اسید نوکلئیک است میتواند به وسیله روشهای معمول ملکولی مثل RT17-PCR18, PCR تکثیر یابند.
-4-1-3 غنی سازی و تکامل19

چون جداسازی گرایشی خالی از اشکال نیست سیکل جداسازی و تکثیر بین 6 تا 12 مرتبه تکرار میشود در این حالت تنوع توالی از حالت ابتدائی sequence -space کمتر است(مثلاً از 10 24 حالت به جمعیتی از 10 توالی مجزا که خصوصیات مورد نظر را نشان میدهند کاهش مییابد) به علت اینکه آنزیمهائی که فرایند همانندسازی اسید نوکلئیک مورد نظر انجام میدهند خاصیت اصلاح اشتباهات را ندارند20؛ پس به راحتی دچار اشتباه میشوند و این یک مزیت است زیرا به وسیله آن می توان نمودی از تکامل داروینی به وسیله انتخاب طبیعی را در برخی موارد مشاهده کرد. چون یکی از مشکلاتی که در مورد RNA در pH های بالا وجود دارد فعال بودن دو ΄oH است که باعث حمله به نوکلوئید مجاور و ایجاد یک نوکلئوتید حلقوی و ناپایداری رشته میشود در بیشتر موارد تصمیم گرفته میشود که یا دو ΄oH را غیر فعال کننده و یا اینکه ساختار پیوند فسفودراتر در ستون فقرات رشته back bone را تغییر دهند. برای غیر فعال سازی دو ΄oH آن را به وسیله یک گروه آمین و یا فلئور جایگزین میکنیم - یکی بار مثبت و دیگری بار منفی دارد و این به نوع کاربرد آپتامر بستگی دارد- بازه قابل توجهی از فعالیتهای آنزیمی برای اسیدهای نوکلوئیک قابل تصوراست و پیوندهای هیدروژنی و سایر خصوصیات آن از جمله واکنشهای اتصالی بین بازهای آنها تولید جعبه ابزاری21 متنوعی از موتیفهای ساختاری را در آنها ایجاد میکند.[8]
-5-1-3 مولکولهای هدف آپتامر

آپتامرها میتوان بر علیه یونها مثلاً Zn2+، تولید نوکلئوتیدها، ATP، اولیگوپپتیدها گلیکوپروتئینهای بزرگ ایجاد کرد.

-4کاربردهای مختلف آپتامرها

به محلهای اتصال آپتامر، آپتاتوپ میگویند. در استفادههای درونتنی22 برای آپتامرها میتوان از آنها به عنوان Magic bullet استفاده کرد که ملکول مورد نظر را تعقیب کرده و از بین ببرند. مهمترین مسأله در مورد آپتامرها و استفاده درونتنی از آنها مسأله فارماکوکینتیک23، اولیگونوکلئوتیدها است. سرعتی که آنها به وسیله سیستم رتیکولوآندوتلیال از مسیر خارج می شوند و سرعت جذب آنها در کلیه ها و سرعت جذب در بافتها و ... مطالعه نیمه عمر آپتامرهای DNA تک رشتهای در خون چیزی شبیه به 2 تا 8 دقیقه را نشان میدهد. البته کانژوگاسیون آپتامرها با لیپیدها و یا پلی اتیلن گلیکول نشان داده است که توانائی بقای آنها به حدی بالا رفته است که میتوانند به عنوان یک عامل درمانی عمل کنند. همچنین از آپتامرها میتوان در ژنتراپی برای جلوگیری از بیان ژنها و … استفاده کرد.[2]

-1-4 استفاده از آپتامرها برای ساخت بیوسنسورها
توانائیهای این بیوسنسورها عبارتند از: اندازهگیری همزمان صدها گونه ملکولی متفاوت، حساسیت بسیار بالا، اختصاصیت بسیار بالا، آنالیز سریع، اصول شیمیایی بسیار ساده که به راحتی میتواند اتوماتیک شود. مسأله مهمتر در مورد بیوسنسورها استفاده از یک تکنیک فلئورسنت بسیار حساس به صورتی است که

می تواند یک ملکول را شناسائی کند. در مورد تکنیک فلئورسنت روشهای محو تدریجی ناحیه تحریک شده بسیار قدرتمند هستند. در این تکنیکها آپتامر را روی یک اسلاید شیشهای قرار می دهند. در این حالت اگر چه نور ایجاد شده تماماً بازتابش میشود، مقداری انرژی به بیرون شیشه در محیط گسترش پیدا میکند که بصورت تعریفی یک ناحیه الکترومگنیک تخریبی را نزدیک سطح شیشه ایجاد میکند این ناحیه را evanescance field میگویند. که خود میتواند بصورت اختصاصی برای تحریک ملکولهای نزدیک سطح شیشه عمل کند با استفاده از این روشها میتوان یک ملکول آپتامر متصل به یک ملکول هدف را شناسائی کرد. پس از انقلابی که DNA چیپها ایجاد کردند.24 حال نوبت به بررسی آنالیزی Proteom و یا تمامی پروتئینهای یک سلول خاص با ژنوم مشخص فرا رسیده است. برای اندازهگیری دقیق و روتین 102 تا 105 پروتئین مختلف به نظر میرسد که ساختن یک aptamer chip مفید واقع شود.25 تفاوت اساسی بین چیپهای DNA و چیپهای آپتامر در نوع واکنشهائی است که بین پروب در چیپ با ملکول هدف در

محلول صورت میگیرد. در DNA چیپها اتصالات از نوع base paiving بین پروب و ملکول مورد نظر صورت میگیرد درحالی که در مورد آپتامر چیپها ملکول دارای ساختار سوم مشخص، به وسیله یک لینکرlinker به سطح چیپ متصل میشود. به عبارت دیگر میتوان گفت که آپتامرها به عنوان یک آنتیبادی عمل میکنند با این تفاوت که حتی از خالصترین آنتیبادیهای مونوکلونال با گرایش بیشتر و اختصاصیت بالاتری عمل میکنند9]، .[10 برای شناسائی آپتامر متصل شده به ملکول هدف چهار روش ارائه شده که به توضیح کوتاه در مورد آنها آمده است

-1-1-4 روش Sand witch technique

این روش استفاده از آپتامر در تکنیکی مشابه Elisa است. در تکنیکی آن را ELANA نامیده اند و در کمپانی نکستار Nextar ایجاد شده یک آنتی بادی مونوکلونال را Immobilized میکنند و آنگاه به وسیله یک آپتامر نشاندار علامتگذاری میشود. اگر چه تا به امروز هنوز از آپتامر هم برای immobilization و هم برای Lableing استفاده نشده است ولی پیشرفتهای جدید افقهای تازه را میگشاید9]، .[10

-2-1-4 روش de-quenching Fluorescent signals in Aptamer Beacons

beacon Molecular ها شامل یک توالی نوکلئوتیدی هستند که در دو طرف خود دارای توالیهای مکمل میباشند این دو توالی انتهائی با یکدیگر base pair میدهند و باعث میشوند که اولیگونوکلئوتید به صورت hair pin درآید. در دو انتهای این اولیگونوکلئوتیدها هم ماده فلئورسنت و هم ماده اطفاءگر26 وجود دارد در صورت عدم اتصال این نشانگر، به هدف در اثرا ایجاد ساختار Stem-loop، ماده فلئورسنت در مقابل quencher قرار میگیرد و در نتیجه نوری ساطع نمیشود و به این ترتیب میتوان Beacon هائی ایجاد کرد که بر علیه ساختارهای دوم و یا سوم مشخص از آپتامرها اختصاصی هستند9]، .[10

ژنومی، بررسی انواع جهشها و تشخیص جهشها در ژنهای خاص، آنالیز بیان ژنوم موجودات در شرایط مختلف، بررسی ژنهای DNA این انقلاب شامل: مطالعه ژنوم، تعیین توالی سریع 24 اختصاصی بافتها و… میشود. 25 Nucleic acid aptamer microarray chip 26 Quencher

6

-3-1-4 روش ModuLation of Fluorescense Anisotropy

در این روش بررسی تغییرات نابرابر در میزان فلئورسانس آپتامر نشاندار صورت میگیرد. یکی از مشکلات این روش این است که بین دو سیلگنال نوری قوی و ضعیف باید سیگنال نوری ضعیفتر را شناسائی کرد. اگر چه اتصال آپتامر به ملکولهای کوچک صورت میگیرد ولی به علت اینکه میزان نوری که از یک ناحیه کوچک ساطع نمیشود کمتر قابل تشخیص است در این روش برای حداقل اندازه هدف آپتامر محدودیت وجود دارد9]، .[10

-4-1-4 روش Modulation of Fluorecunt emission by signaling Aptamer

وقتی که آپتامرها به لیگاندهای خود متصل میشوند دچار تغییر شکل فضائی میشوند و در تحقیقاتی که در آزمایشگاههای دانشگاه Ellington صورت گرفته است مشخص شده که میزان شدت فلئورسنت تابش یافته پس از اتصال آپتامر به لیگاند دچار تغییرات قابل تشخیص میشود و به این طریق میتوان اتصال آپتامرها به اهدافشان را نشان داد9]، .[10

-2-4 تشخیص سرطان به کمک آپتامرها

هر یک از سلولهای بدن انسان، پروتئینهای خاصی را بیان میکنند. به مجموعه پروتئینهایی که در هر یک از انواع سلولها بیان میشود، پروتئوم27 گفته میشود. پروتئوم هر سلول مانند اثر انگشتی است که به کمک آن میتوان نوع سلول و سن آن را مشخص کرد. سلولهای سرطانی و یا سلولهایی که در حال سرطانی شدن هستند نیز دارای پروتئوم خاصی هستند که میتوان با بررسی آنهاسلولهای سرطانی را مشخص کرد. در سلولهای سرطانی علاوه بر آنکه نحوه بیان ژن ها تغییر میکند، مقدار بیان آنکوپروتئینها افزایش مییابد که با مشخص کردن این افزایش میتوان به سرطانی شدن سلول پی برد.

بررسی بیان همه پروتئینهای بیان شده در یک سلول بوسیله آپتامرها بصورت تک به تک، بسیار زمانگیر است. به همین منظور روشی ابداع شده که به کمک آن بتوان همه انواع پروتئینهای یک سلول را بطور همزمان بررسی کرد. در این روش همه آپتامرهای لازم برای شناسایی پروتئوم یک سلول بصورت ریزآرای28 بر روی یک صفحه کوچک، متصل شدهاند. این آپتامرها با مواد فلوئورسانتی مانند رودامین، نشاندار شده اند. برای شناسایی پروتئوم سلول ابتدا عصاره سلولی بر روی ریزآرایه قرار داده میشود، در این هنگام پروتئینهای سلول به آپتامرهای خود که هر یک در محل ویژهای از ریزآرایه قرار دارد، متصل میشوند. پس از شستشو، سطح ریزآرایه توسط یک اسکنر اسکن میشود. اتصال پروتئین ها به آپتامر ها باعث میشود ساختار فضایی آپتامر،کمی تغییرکند که این امر موجب تغییر در شدت تابش فلوئورسانت آپتامر میشود. به این ترتیب به کمک اسکنر میتوان مشخص کرد که در چه آپتامرهایی شدت تابش فلوئورسانت تغییر کرده و با توجه به آن پروتئوم سلول را مشخص کرد. روش فوق بویژه برای شناسایی سلولهای سرطانی در سرطان پستان،کاربرد زیادی پیدا کرده است. در این روش میتوان با بررسی مرحله به مرحله سلول، مراحل پیشرفت سرطان را بررسی کرد.[11]

-3-4 تعیین متابولیتهای سلولی

یکی از علائم بیماریهای مختلف، افزایش یا کاهش مقدار متابولیت های سلولی است. به کمک آپتامرها میتوان مقدار متابولیتهای سلولی را به دقت اندازهگیری کرد. برای مثال در یکی از روشهای تشخیص بیماری فنیل کتونوری، از آپتامر بر علیه ال- فنیل آلانین استفاده میشود. در بیماری فنیل کتونوری مقدار ال-فنیل آلانین در خون افزایش مییابد.که با اندازهگیری مقدار فنیل آلانین خون، میتوان این بیماری را تشخیص داد. در این روش مقدار مشخصی از آپتامرهای نشاندار با مواد فلوئورسانت، با مقدار مشخصی از سرم خون بیمار مخلوط میشوند. در این هنگام مولکولهای ال-فنیل آلانین موجود در سرم خون، به آپتامرها متصل شده و باعث تغییر شدت تابش فلوئورسانت آنها میشوند. هرچه مقدار فنیل آلانین خون بیشتر باشد، تعداد فنیل آلانینهایی که به آپتامر متصل میشود، بیشتر بوده و در نتیجه تغییر شدت تابش فلوئورسانت محلول نیز بیشتر خواهد بود. این تغییرات را میتوان با یک اسپکتروفتومتر ساده، اندازهگیری کرد. با تهیه یک منحنی استانداردکه تغییرات شدت تابش فلوئورسانت را بر حسب تغییر مقدار فنیل آلانین نشان میدهد، میتوان به راحتی غلظت ال-فنیل آلانین را در خون بیمار مشخص کرد.[12]

-4-4 تشخیص مولکولی بیماریهای عفونی

آپتامرها، مولکولهای بسیار مناسبی برای تشخیص مولکولی بیماریهای عفونی، بخصوص عفونتهای ویروسی میباشند. برای این منظور کافی است برای هر یک از پروتئینهای اختصاصی باکتری یا ویروس مورد نظر،آپتامر ساخته شود. به کمک این آپتامر میتوان از طریق روشهای مختلف به شناسایی عامل عفونت پرداخت. همانگونه که پیشتر ذکر شد، یکی از مهمترین این روشها، روشELANA است.اصول کلی این روش مشابه روش ELISA است. باین تفاوت که در این روش از آپتامرها به جای آنتیبادی استفاده میشود. در روش ELANA، ابتدا آنتیژنهای سرم بیمار بر روی سطح چاهکهای ویژهای پوشانده شده وسپس آپتامرهای اختصاصی بر علیه آنتیژنهای عامل بیماریزا به آن اضافه میشود. پس از شستشوی سطحی،آپتامر نشانداری بر علیه آپتامر اولیه اضافه میشود. آپتامر ثانویه اغلب به صورت آنزیمی نشاندار میشود. در این روش، آنزیم پراکسیداز خردل 29HRP به آپتامر ثانویه متصل میشود. سوبسترای این آنزیم، ماده لومینول میباشد که بوسیله آنزیم فوق به یک ماده که دارای خاصیت نورافشانی (لومینسانس(30 است، تبدیل میشود. با اضافه کردن سوبسترا به هریک از چاهکها و مشاهده تغییر رنگ ایجاد شده، میتوان به وجود آنتیژن پی برد. تاکنون از روش فوق برای شناسایی عفونت با ویروسهای هپاتیت B، ویروس ایدز و ویروس هرپس سیمپلکس((HSV، استفاده شده است.[13]

-1-4-4 تشخیص مولکولی بیماریها
هر یک از مولکول های RNA دارای توالی خاصی هستند. توالی اسیدهای نوکلئیک باعث میشود که آنها دارای ساختار سه بعدی خاص خود شوند. این ساختار، در اثر پیوندهای هیدروژنی واتسون-کریک و پیوند های هیدروژنی هوگستین31 ایجاد میشود. برخی از این مولکول هایRNA در ساختار فضایی خود دارای جایگاهی هستند که میتوانند از طریق این جایگاه به دیگر مولکولها متصل شوند. اتصال این جایگاهها به مولکولهای مختلف به علت شکل فضایی خاص آنها و برقراری پیوندهای واندروالس و هیدروژنی با آن

مولکولها است. این اتصال بسیار اختصاصی و دارای میل ترکیبی32 زیادی است. به این مولکولهای RNA، آپتامر و به جایگاه اتصال آنها آپتاتوپ33 گفته میشود. این عمل آپتامرها همانند عمل آنتیبادیها است. اما آپتامرها نسبت به آنتیبادیها بسیار اختصاصیتر عمل میکنند و با قدرت بیشتری به لیگاند متصل میشود. آپتامرها دارای سرعت اتصال بالا34 و سرعت تفکیک35 پایین هستند. آپتامرها، لیگاندهای بسیار متنوعی از جمله یونها، متابولیتهای سلولی، ویتامین ها، ویروسها و داروهای مختلف مانند آسپیرین و....را شناسایی میکنند. آپتامرها حتی میتوانند انانتیومرها فضایی مولکولهای مختلف مانند کافئین و تئوفیلین را تشخیص دهند 2]، .[3