بخشی از مقاله
بررسی ارتباط پلیمورفیسمهاي شایع ژن پذیرنده ویتامین (VDR) D با استعداد
ابتلاء به سل ریوي
چکیده
زمینه و هدف: ابتلاء به بیماري سل علاوه بر مواجهه با مایکوباکتریوم توبرکولوزیس (Mycobacterium tuberculosis-MTB)،
تحت تأثیر عوامل محیطی و ژنتیکی میزبان بوده و تنها کمتر از %10 آلـوده شـدگان علائـم بـالینی بیمـاري را بـروز مـیدهنـد.
متابولیسم ویتامین D سبب فعال شدن ماکروفاژها گردیده و از تکثیر درون سلولی مایکوباکتریوم جلوگیري میکند. ایـن رونـد میتواند تحت تأثیر پلیمورفیسمهـاي شـایع ژن پذیرنـده ویتـامین (Vitamin D Receptor –VDR) D قـرار گیـرد. در ایـن
مطالعه اثر تغییرات ژنتیکی VDR در ابتلاء به بیماري سل ریوي مورد بررسی قرار گرفته است.
روش بررسی: این مطالعه به صورت Case-control در جمعیت ایرانی انجام شده است. در ایـن بررسـی، اثـر 4
پلیمورفیسم شایع ژن پذیرنده ویتامین D (این پلیمورفیسمها بـر مبنـاي اثـر آنـزیمهـاي محـدودگري کـه آنهـا را شناسایی میکنند، نامگذاري شدهانـد و عبارتنـد از: FokI (F/f)، BsmI (B/b)، TaqI (T/t) و (ApaI (A/a) در 96
بیمار مبتلا به سل ریوي و 122 فرد سالم در گروه کنترل مورد مطالعه قـرار گرفـت. در ایـن مطالعـه از یـک تکنیـک
(Polymerase Chain Reaction with Sequence-Specific Primers) PCR-SSP اصــلاح شــده توســط
آزمایشگاه ما براي تشخیص پلیمورفیسمهاي این ژن استفاده گردید. جهت مقایسه بـین مبتلایـان بـه سـل ریـوي و افراد سالم گروه کنترل، از آزمون مجذور کاي (Chi-square) استفاده شد.
یافتهها: مشخص گردید که فراوانی اللی و ژنوتایپی نواحی پلی مورفیک ژن VDR در گروههاي بیماران و افـراد سالم اختلاف معنیداري با همدیگر ندارند.
نتیجهگیري: این نتایج اهمیت پلیمورفیسمهـاي ژنتیکـی VDR در ابـتلاء بـه بیمـاري سـل را در جمعیـت ایرانـی غیرمحتمل نشان میدهد.
کلیدواژهها: -1 سل ریوي -2 ویتامین -3 D پذیرنده ویتامین -4 D پلیمورفیسم ژنتیکی
مقدمه
سل، یکی از مشکلات بهداشتی مهم در سراسر جهـان است. این بیماري توسـط مایکوبـاکتریوم توبرکولـوزیس
(Mycobacterium tuberculosis-MTB) ایجــاد شــده و غالباً ریهها را درگیر میکند. حدود یـک سـوم از جمعیـت جهان به این میکروب آلوده هستند و از این تعداد سـالانه 8 میلیون نفر به بیماري سل مبتلا میگردنـد کـه بـیش از 2 میلیون نفرآنها در اثر این بیماري میمیرند.((1 در اکثر افراد یک پاسخ ایمنی مـؤثر بعـد از عفونـت بـا
MTB ایجاد شده که از گسترش پاتوژن جلوگیري میکنـد و کمتر از 10 درصد آلوده شدگان علائم بالینی بیمـاري را بروز مـیدهنـد. در بـین مبتلایـان تنهـا تعـداد کمـی داراي ریسک فاکتورهاي شناخته شدهاي نظیر دیابـت، سـن بـالا، مــصرف الکــل، عفونــت بــا ویــروس HIV و اســتفاده از داروهاي کورتیکواستروییدي میباشند. احتمالاً ترکیبـی از فاکتورهاي محیطی و ژنتیکی سبب ایجاد بیماري میشـود.
تفـاوتهـاي نـژادي موجـود در ابـتلاء بـه بیمـاري سـل و همچنین مطالعاتی که بر روي دوقلوهاي منوزیگوت انجام شـده، نـشاندهنـده نقـش مـؤثر فاکتورهـاي ژنتیکـی در حساسیت به بیماري سل است.((2
در کنترل عفونت MTB ایمنی ذاتی نقش مهمـی بـه عهـده دارد. متعاقــب ورود باســیل ســل از راه تــنفس بــه بــدن، ماکروفاژهاي آلوئولی از طریق پذیرندههاي غـشایی خـود از جمله پذیرندههاي شبه (Tool Like Receptors-TLRs) Toll،
باکتري را شناسایی کرده و علاوه بر بلع آن بـا ایجـاد یـک پاسخ التهابی، خط مقدم دفاع علیه مایکوبـاکتریوم را ایجـاد میکنند. سایتوکاینهاي تولید شده توسط ماکروفاژها سبب فراخوانی سایر سلولهاي ایمنـی ذاتـی شـامل سـلولهـاي کشنده طبیعی (Natural Killer-NK) و لنفوسـیتهـاγδ T d به موضع گردیده که به نوبه خود با ترشح سایتوکاینهـاي فعالکننده ماکروفـاژ، ظرفیـت نابودسـازي مایکوبـاکتریوم توسط این سلولها راافزایش میدهند.
شواهد اپیـدمیولوژیک مویـد ایـن مطلـب اسـت کـه در %70 موارد، این پاسخ التهابی مبتنی بر ایمنـی ذاتـی بـه تنهـایی کـافی بـوده و مـیتوانـد سـبب نـابوديMTB گـردد؛ در بـسیاري از افرادي که با مسلولین تماس مستقیم داشـتهانـد، آزمـایش PPD
مثبت نمیشود که این خود بر حذف باسیل سل بدون مشارکت سلولهاي T و ایجاد خاطره ایمونولوژیک دلالت دارد.((3
در سایر موارد، پاسخ ایمنی ذاتی به تنهایی کافی نبـوده و پس از عرضه آنی ژنهاي باکتري توسط سلولهاي دندریتی به لنفوسیتهاي T در گرههاي لنفاوي موضـعی پاسـخ ایمنـی اکتسابی فعال میگردد؛ در نتیجه پس از تکثیر لنفوسیتهاي T
و مهاجرت آنها به ریه، تشکیل گرانولوما که یـک پاسـخ TH1 میباشد، موجب محدود شدن عفونت خواهد شد.
پذیرنـده ویتـامین (Vitamin D Receptor-VDR) D کـه عــضوي از خــانواده پذیرنــدههــاي اســتروییدي اســت در لنفوسیتهايT و B فعال شـده و منوسـیت هـا/ماکروفاژهـا وجود دارد و همین امر سبب شده که ویتـامین D بـه عنـوان یک تنظیمکننده سیستم ایمنی مطرح گردد.((4 نقش تنظیمی این ویتامین از طریق اتصال فرم فعال آن یعنی 1,25(OH)2D3 به
VDR انجام میگیرد.((5
ویتامین D سبب تعادل الگوي TH1/TH2 مـیگـردد. ایـن کار با تأثیر منفی بر سلولهاي TH1 و یا اثر تنظیمـی مثبـت بر سلولها TH2 اعمال میشود.((4 در حقیقت 1,25(OH)2D3 ســبب کــاهش تولیــد ســایتوکاینهــاي TH1 شــده و ســنتز سایتوکاینهاي TH2 را افزایش میدهد. از طـرف دیگـر، در مطالعــات آزمایــشگاهی نــشان داده شــده کــه نگهــداري منوســیتهــاي انــسان (کــه پذیرنــده ویتــامینِD دارنــد) در مجاورت فرم فعال ویتـامین D باعـث افـزایش توانـایی ایـن سلولها در ممانعت از رشد MTB میگردد.((6
در افــراد مبــتلا بــه ســل، تولیــد 1,25(OH)2D3 توســط سلولهاي T فعال شده در محل گرانولومـا و یـا ویتـامین D
موجود در خـون محیطـی مـیتوانـد سـبب افـزایش توانـایی ماکروفاژهـا در ممانعـت از رشـد مایکوبـاکتریوم گـردد. بـه عبارت دیگر اگر فردي دچار کمبود ویتامین D باشد، به علـت وجود نقص در عملکرد ماکروفاژها و منوسیتها، بیـشتر در معرض ابتلاء به بیماري سل است.((7 از طرفی چون ویتـامین D از طریق پذیرنده خود بر سـلولهـاي سیـستم ایمنـی اثـر میکند، این احتمال وجود دارد که پلیمورفیسمهـاي ژنتیکـی VDR پاسخ سلول به ویتامین D را تحت تـأثیر قـرار داده، از این طریق باعث حساسیت و یا مقاومت به بیماري سل گردند.
ارتباط این پلیمورفیسمهـا بـا بیمـاري سـل ریـوي در کشورهایی نظیر تانزانیا،((8 آفریقـاي جنـوبی،((9 چـین((10 و
گامبیا((11 نیز مورد بررسی قرار گرفته است. هدف از انجام این پژوهش تعیین اثر پلیمورفیسمهـاي ژنتیکـی VDR در ابتلاء به بیماري سل ریوي در جمعیت ایرانی بود.
روش بررسی
گروه بیمار و کنترل
این مطالعه به صورت Case-control بـر روي 96 بیمـار ایرانی مبتلا به سل ریوي که در فاصله زمانی شـهریور مـاه
1386 تا بهمن ماه همان سال، به بیمارستان مسیح دانشوري
(دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی) واقـع در شـهر تهـران مراجعه کرده بودند، انجام گردید. در این مطالعه، افراد داراي بیماري دیابت، مبتلایان به ایدز و مصرفکنندههاي داروهاي
کورتیکواستروییدي و کلیه افرادي که از نژادهاي غیر ایرانی بودند از گروه بیمـاران حـذف گردیدنـد. همچنـین 122 فـرد مراجعــهکننــده بــه مرکــز تحقیقــاتی- آموزشــی علــوم آزمایشگاهی (دانشگاه علوم پزشکی ایران)، که سلامت آنها توسط معاینات پزشکی تأیید شده بود به عنوان گروه کنترل انتخاب شده و مورد بررسی قرار گرفتند.
روش انجامGenotyping ژن VDR
در این مطالعه پلیمورفیـسمهـاي FokI، BsmI، ApaI و TaqI که به ترتیب در اگزون 2، اینترون 8، اینترون 8 و
اگـــزون 9 از ژن VDR قـــرار دارنـــد، مـــورد بررســـی قرار گرفتند. براي تعیین پلـیمورفیـسمهـاي ژن VDR از تکنیــــک Polymerase chain reaction -) PCR-SSP(sequence specific primers کـه قـبلاً توسـط Soborg و Lombard طراحـی شـده بـود، بـا انجـام تغییراتـی
در پرایمرهــا و بهینــه ســازي مجــدد واکــنش، اســتفاده گردیــد. جــدول شــماره 1 تــوالی پرایمرهــاي اســتفاده شــده و انــدازه محــصولات PCR را نــشان مــیدهــد.
بــــه عنــــوان کنتــــرل داخلــــی در واکــــنش PCR از پرایمرهـــــاي 5'TGCCAAGTGGAGCACCCAA3' و 5'GCATCTTGCTCTGTGCAGAT3' کـــه قطعـــهاي بهاندازه 796 زوج باز را در اینترون 3 ژن DRB1 تکثیـر
میکنند، استفاده شد.
به منظور تهیـه DNA از هـر یـک از بیمـاران و افـراد گروه کنترل، 3 میلیلیتر خون گرفته شد وDNA آنها بـه روش Salting-out اســتخراج گردیــد. واکــنش PCR در حجم کل 15 میکرولیتر در محیط بافري سـولفات آمـونیم انجام شد. ایـن واکـنش تحـت شـرایط غلظتـی زیـر در 2
واکــــنش جداگانــــه بــــراي بررســــی هــــر کــــدام از پلیمورفیسمهاي ژن VDR انجام گردید: مقدار DNA در هــــر واکــــنش 75-100 ng، غلظــــت dNTPs معــــادل
200 میکرومولار، غلظت1/5 MgCl2 میلـیمـولار، غلظـت هــر کــدام از پرایمرهــاي اختــصاصی بــین 0/5 تــا 2
میکرومــولار، غلظــت پرایمــر کنتــرل 0/1 میکرومــولار و غلظت آنزیم 0/5 Taq DNA Polymerase واحد.
واکــنش زنجیــرهاي پلیمــراز بــا اســتفاده از دســتگاه (Mastercycler) Eppendorf و بهور همزمان بـراي تمـامی پلیمورفیسمها تحـت شـرایط دمـایی و زمـانی یکـسان بـه ترتیب زیر انجام گردید: 2 دقیقه در 94 °C بـراي بـاز شـدن اولیـــه زنجیـــرههـــاي DNA؛10ســـیکلِ 10 ثانیـــهاي در 94 °C و 1 دقیقــهاي در 65 °C؛ 20 ســیکلِ 10 ثانیــهاي در
94 °C، 50 ثانیهاي در61 °C و 30 ثانیهاي در .72 °C بعـد از انجام PCR، محصولات حاصـل از واکـنش در ژل آگـاروز
1/5 درصد الکتروفورز شد و پس از عکسبرداري ژنوتایپ افراد مشخص گردید (شکل شماره .(1
شکل شـماره -1 الگـوي ژنوتایپینـگ VDR بـا اسـتفاده از تکنیـک PCR-SSP در یک فرد. ژنوتایپ این فرد FF، Bb، Tt و Aa میباشـد.
محصول بزرگتر 796) زوج باز) که در پشت محصولات اختصاصی قرار دارد و در تعدادي از خانهها قابل مـشاهده اسـت در اثـر تکثیـر قطعهاي از اینترون سوم ژن DRB1 حاصل میگردد.
بعد از انجـام ژنوتایپینـگ، فراوانـی اللـی و ژنوتـایپی پلیمورفیسمهاي ژن VDR در گروههاي کنتـرل و بیمـار مشخص گردید و توسط آزمون مجذور کـاي (نـرمافـزار(SPSS V.12 مقایسه شد.
یافتهها
فراوانی اللی و ژنوتایپی پلیمورفیـسمهـاي ژن VDRدر بیماران و افراد سالم در جدول شـماره 2 نـشان داده شده است. با آنالیز آمـاري مـشخص گردیـد کـه تفـاوت معنیداري بین نتایج دو گروه بیمار و کنترل وجود ندارد.
بحث
حساسیت و یا مقاومت به بیماري سل در اثر تعامل پیچیدهاي که بین ژنتیک میزبان و فاکتورهـاي محیطـی وجود دارد، شکل می گیرد. در مطالعاتی که قـبلاً انجـام
