بخشی از مقاله
مروری بر عوامل موثر بر طراحی داربست های مهندسی بافت غضروف: مشکلات و استراتژی ها
چکیده
در این مقاله مروری ما به بررسی پارامترهای موثر در طراحی داربست های مورد استفاده در مهندسی بافت غضروف می پردازیم. از آن جمله می توان به تاثیر منابع مختلف سلولی مزیت ها و معایب هریک ، ژئومتری و خواص سطح داربست ، معماری داخلی و خارجی آن ، تاثیر پارامترهایی نظیر اندازه منافذ ، شکل منافذ ، درصد تخلخل ، قطر فیبرها (مقایسه نانو فیبرها و میکروفیبرها) و جهت گیری فیبرها بر روی تشکیل بافت مهندسی شده اشاره کرد. در این مقاله همچنین به اصلاح سطح داربست ، استفاده از نانو ذرات برای رهایش فاکتورهای رشد و ژن های آنها و تثبیت این نانوذرات بر روی داربست ها به عنوان حامل پرداخته شده است. از جمله موارد بررسی شده ، مشکلات وکمبودهای غضروف مهندسی شده ( مانند کمبود مقدار کلاژن ، عدم جهت گیری درست آن و عدم تشکیل نواحی چهارگانه غضروف طبیعی ) و ارائه روش هایی مانند بیوراکتورهای دارای فشار مکانیکی و داربست های ناحیه ای (Zonal) به منظور بهبود خواص بافت غضروف سنتزی ، می باشد.
واژه های کلیدی: مهندسی بافت ، طراحی داربست ، نانوفیبر ، اصلاح سطح ، داربست ناحیه ای
مقدمه
غضروف مفصلی ، به علت توانایی مقاومت آن در برابر استرس های فشاری مکرر در طول زندگی فرد یک بافت منحصر به فرد محسوب می شود. با این حال ، محدودیت بزرگ آن ، عدم توانایی درمان ، حتی در جراحات جزئی است. .(Matsiko et al., 2013:1) زمینه مهندسی بافت غضروف مفصلی ، که هدف آن ترمیم، بازسازی و یا بهبود غضروف مفصلی آسیب دیده و یا بیمار است، علاقه شدیدی را برانگیخته و دارای پتانسیل زیادی برای بهبود درمان غضروف مفصلی است. .(Zhang, Hu, & Athanasiou, 2009:1) در حالی که مهندسی بافت و پزشکی ترمیمی به وعده های های زیادی در چند دهه گذشته اشاره کرد، هنوز تحقیقات قابل توجهی برای ارائه مواد جایگزینی که در نهایت به حل مشکلات مرتبط با ایمپلنت های معمولی بیانجامد، نیاز است. فناوری نانو و یا استفاده از نانومواد ممکن است مفید باشد، از آنجایی که تنها نانومواد می توانند خواص سطح ( شامل توپوگرافی، انرژی و غیره ) بافت طبیعی را تقلید کنند. بر این اساس، در دهه گذشته، نانومواد به عنوان کاندید مناسب برای بهبود مواد معمولی مهندسی بافت شناخته شده است. نانومواد، زیست سازگاری ، خواص مکانیکی، الکتریکی، نوری، کاتالیستی و مغناطیسی برتری را در مقایسه با مواد معمولی ارائه می دهند. خواص منحصر به فرد نانومواد، به بهبود رشد بافت های مختلف بیش از آنچه که امروزه بدست آمده، کمک کرده است. .) Zhang & Webster, 2009:1) در طول دو دهه گذشته، طرح ها و روش های ساخت مختلفی برای توسعه داربست های مهندسی بافت، برای ساخت جایگزین های مصنوعی قابل کاشت بافت غضروف، بررسی شده است. در حال حاضر پیشرفت در فن آوری ساخت، طراحی استراتژیک داربست هایی با خواص و ساختارهای زیست- مقلد پیچیده را امکانپذیر می کند. به ویژه، داربستهایی با طرح ترکیبی و یا ناحیه ای زیست ـ مقلد، اخیرا برای کاربرد مهندسی بافت غضروف بافت توسعه یافته است. . (Izadifar et al., 2012:1) هنوز هم فقدان استراتژی که باعث تحریک رشد غضروف مفصلی شبه هیالینی با خواص عملکردی مناسب شود، وجود دارد. . (Matsiko et al., 2013:1) در این مقاله جنبه های مهمی از طراحی داربست مهندسی شده برای ترمیم غضروف مفصلی و همچنین اصلاح سطح داربست ها و استفاده از نانوذرات به عنوان حامل های فاکتور رشد در مهندسی بافت غضروف ، بررسی شده است.
-1 غضروف مفصلی طبیعی
-1-1 ساختار
غضروف مفصلی، به طور معمول با 5 - 2 میلی متر ضخامت (Burdick & Mauck, 2011:280) ، یک بافت صاف نیمه شفافی است که انتهای دیستال استخوان ها در مفاصلی مثل زانو و آرنج را می پوشاند. این بافت یک سطح با اصطکاک کم ، برای تسهیل حرکت استخوانهای مفصلی فراهم می آورد و قادر به پشتیبانی از بارهای فشاری (compressive loads) بالاست. خواص بیومکانیکی منحصر به فرد آن به دلیل ماتریکس خارج سلولی )ECM( است که توسط سلولهای غضروفی یعنی کندروسیت ها ترشح می شود. ECM غضروف ( تقریبا %95 بافت غضروف را تشکیل می دهد ( (Burdick & Mauck, 2011:280) ، شامل فیبرهای کلاژن تیپ II که % 60 وزن خشک غضروف مفصلی را تشکیل می دهند و بافتی با استحکام کششی بالا را فراهم می کنند و پروتئوگلیکان خاص غضروفی، اگریکان %35) از وزن خشک غضروف) که بافت غضروفی با توانایی پشتیبانی از بارهای فشاری بالا را ایجاد می کنند.
.(Izadifar et al., 2012:3)
ECM غضروف از پروتئوگلیکان های کوچک و بزرگ تشکیل شده است. پروتئوگلیکان های کوچک آن شامل دکورین ، بیگلیکان و فیبرومدولین است. اگریکان (پروتئوگلیکان عمده) شامل بسیاری از گلیکوزآمینوگلیکان های شاخه ای - (GAGs) در درجه اول کراتین سولفات )KS( و کندرویتین سولفات - )CS( که به هر مولکول اگریکان بار منفی بزرگ می دهد. مولکول اگریکان از طریق یک پروتئین لینکر به یک زنجیره بلند هیالورونیک اسید غیرشاخه ای ، متصل می شود. . (Burdick & Mauck, 2011:281) چگالی بالای بار منفی ، پتانسیل اسمزی را ایجاد می کند که آب را از مایع سینوویال حفره مفصلی و بافت های مجاور ، به ماتریکس غضروف می کشد. بنابراین، تقریبا %80 وزن کل غضروف مفصلی را آب تشکیل می دهد و این یک فاکتور بسیار مهم برای عملکرد تحمل بار محسوب می شود. %90 . (Izadifar et al., 2012:3) کل محتوای کلاژن غضروف ، کلاژن تیپ II می باشد. دیگر انواع کلاژن ، مابقی کلاژن بافت را تشکیل می دهند و شامل کلاژن تیپ IX , XI و X می باشند.
کندروسیت ها ارتباط سلول ـ سلول محدودی دارند. این سلول ها اطلاعات را از طریق نیروهای مکانیکی و میانکنش با فاکتورهای رشد و سایتوکاین ها دریافت می کنند. ECM ای که مستقیما سلول را احاطه کرده ، ماتریکس پری سلولار و یا Lacunar نامیده می شود. این منطقه پروتئوگلیکان های فراوان و فیبرهای کلاژنی کمی دارد. کندروسیت در محیط کم اکسیژن وجود دارد و در نتیجه متابولیسم آنها از طریق مسیرهای غیرهوازی ، به ویژه گلیکولیز می باشد. اگر چه کندروسیت ها اجزا ECM را تولید می کنند ، اما معمولا آنها بعد از دوره بلوغ تقسیم نمی شوند. تراکم سلولی کم و تقسیم پایین ، هر دو باعث ظرفیت محدود ترمیم بافت می شود.
. (Burdick & Mauck, 2011:281 )
-2-1 اجزا غضروف
غضروف مفصلی طبیعی دارای یک ساختار لایه لایه و یا ناحیه ای است. آن دارای چهار لایه به نام های ناحیه سطحی، ناحیه میانی (یا انتقالی) ، ناحیه عمیق و ناحیه کلسیفیه می باشد. این نواحی با توجه به ترکیب مولکولی و سازمان ECM غضروف، شکل و تراکم کندروسیت های آن ناحیه و خواص مکانیکی آن ، از یکدیگر متفاوت هستند. (شکل (1
(Zhang et al., 2009:4)
(Izadifar et al., 2012:4)
(Zhang et al., 2009:4)
(Burdick & Mauck, 2011:282)
شکل (1) نواحی تشکیل دهنده بافت غضروف
ناحیه سطحی %20-%10 کل ضخامت بافت را تشکیل می دهد. . (Izadifar et al., 2012:4) این ناحیه توسط سلول ها و فیبر کلاژن که موازی سطح جهت گیری کرده اند، مشخص می شود. این سلول ها کوچک و دیسکی شکل اند. بالاترین تراکم سلولی و پایین ترین
تراکم پروتئوگلیکانی در این منطقه است. . ناحیه سطحی نخستین لایه در پاسخ به تنش های
کششی و برشی است.
ناحیه میانی %60-%40) از ضخامت غضروف مفصلی) توسط فیبرهای کلاژنی با جهت گیری تصادفی و بالاترین محتوای پروتئوگلیکان در بین نواحی دیگر، مشخص می شود. . . (Izadifar et al., 2012:4) این سلول ها به همراه فیبرهای کلاژنی جهت گیری تصادفی دارند و نسبت به سلولهای ناحیه سطحی کروی ترند. . (Burdick & Mauck, 2011:282)
ناحیه عمیق %40-%30) از ضخامت غضروف مفصلی) فیبرهای کلاژنی ستونی ، با قطر بیشتر و و محتوای پروتئوگلیکانی پایین تر از ناحیه میانی را ارائه می دهد. سلول های ناحیه عمیق کمی کشیده و دراز (Izadifar et al., 2012:4) و همراه با فیبرهای کلاژنی در ستون هایی عمود بر سطح قرار دارند. . (Burdick & Mauck, 2011:282) علاوه بر این، سلول ها در ناحیه عمیق فعالیت های سنتزی بیشتری (ده برابر) را نشان می دهند. همچنین ، سلول های ناحیه عمیق بر روی پلاستیک های محیط کشت (TCP) اتصال و انتشار سریعتری داشته و کراتین سولفات بیشتری نسبت به سلول های سایر نواحی تولید می کنند. . (Zhang et al., 2009:4 )
منطقه کلسیفیه ، لایه انتقالی بین بافت غضروف هیالین و بافت استخوان ساب کندرال بازال است. .(Izadifar et al., 2012:4) این ناحیه محتوی کندروسیت های هایپرتروفیک (Nooeaid, Salih, Beier, & Boccaccini, 2012:2) فرورفته در ECM کلسیفیه است.
. در ناحیه کلسیفیه ECM غضروف ، مینرالیزه شده و کلاژن تیپ II با کلاژن تیپ X جایگزین شده است
که به حفظ تمامیت بافت غضروف کمک می کند. .
-3-1رفتار مکانیکی غضروف
غضروف یک بافت دوفازی است که از فاز مایع و جامد تشکیل شده است، این دو فاز به این بافت خواص ویسکوالاستیکی می دهند. . (Zhang et al., 2009:4) فاز جامد شامل اجزای پروتئوگلیکان ها، کلاژن، سلول، و چربی ها هستند. . (Mansour, 2004:69) فاز مایع تراکم ناپذیر غضروف ، همان مایع میان بافتی است. . (Zhang et al., 2009:4) به طور معمول، فاز جامد را به عنوان یک ماده الاستیکی و فاز مایع را به عنوان ماده تراکم ناپذیر ، در نظر می گیرند. تحت فشارهای ضربه ای، غضروف به عنوان یک تک فاز، یعنی فاز جامد تراکم ناپذیر الاستیکی ، رفتار می کند.
با استفاده از مدل دو فازی ریاضی ، دو خاصیت مواد غضروفی تعیین می شود: مدول تجمعی (aggregate modulus) و نفوذ پذیری .(permeability) مدول تجمعی ، میزانی از سفتی بافت در حالت تعادل است ، زمانی که همه جریان مایع ، متوقف شود. هرچه مدول تجمعی بالاتر باشد، تغییر شکل بافت تحت بار کمتر است. مدول تجمعی غضروف معمولا بین 0/9-0/5 مگاپاسکال است. همچنان که آب افزایش می یابد، مدول تجمعی کاهش می یابد. مدول یانگ غضروف بین 0/8-0/45 مگاپاسکال است. نفوذ پذیری، مقاومت در برابر جریان مایع در ECM غضروف است. نفوذ پذیری غضروف مفصلی در نزدیکی سطح ، بالاترین میزان (جریان مایع نسبتا آسان است) و کمترین میزان در ناحیه عمیق (جریان مایع نسبتا مشکل) است. همچنان که غضروف فشرده می شود، نفوذ پذیری آن کاهش می یابد. افزایش نفوذ پذیری، اجازه جریان آسان تر مایع به بیرون از بافت را می دهد و در نتیجه سرعت و میزان تغییرشکل را بیشتر می کند. همچنان که مقدار آب افزایش می یابد، نفوذ پذیری هم افزایش می یابد. . (Mansour, 2004:69-72)
از آنجا که هر چهار ناحیه، دارای کلاژن هایی با سازمان و قطر متفاوت و مقدار متفاوتی از پروتئوگلیکان هستند ، خواص کششی و فشاری هر ناحیه نیز متفاوت است. . (Zhang et al., 2009:5) برای مثال سختی فشاری غضروف به عنوان یک تابعی از محتوای گلیکوزآمینوگلیکان با افزایش آن ، افزایش می یابد. در مقابل، هیچ همبستگی بین سختی فشاری و کلاژن وجود ندارد.
. (Mansour, 2004:72 )
-2 منابع سلولی
منبع سلولی بهینه برای مهندسی بافت غضروف هنوز کاملا شناخته نشده است. کندروسیت ها، فیبروبلاست ها، سلول های بنیادی و سلول های اصلاح ژنتیکی شده ، بخاطر پتانسیل شان به عنوان منبع سلولی برای ترمیم بافت غضروف معرفی شده اند.
-1-2 کندروسیت
کندروسیت های تمایزیافته ، با مورفولوژی گرد و تولید مولکولهای ECM همانند کلاژن تیپ II و گلوکوزآمینوگلیکان های سولفاته ، مشخص می شوند. . (C. Chung & Burdick, 2008:2) با این حال، تنها مقدار کمی از کندروسیت ها در دسترس هستند و سلول های حاصل از مفاصل بیمار ، نسبتا غیر فعال هستند. متاسفانه کشت کندروسیت به صورت تک لایه باعث از دست دادن تمایزشده که با کاهش سنتز پروتئوگلیکان و کاهش بیان کلاژن تیپ II و افزایش بیان کلاژن تیپ I مشخص می شود. سن کندروسیت ها نیز موضوعی
است که باید در نظر گرفته شود.
-2-2 سلول های بنیادی
یک راه حل ممکن برای غلبه بر محدودیت منبع کندروسیت ها، استفاده از سلول های بنیادی چندتوان است (Kock et al., 2012:2) که می تواند به چندین رده سلولی تمایز یابد. (C. Chung & Burdick, 2008:6) انواع سلول های بنیادی که در مهندسی بافت غضروف استفاده می شوند شامل:
سلول های بنیادی مشتق شده از مغز استخوان )BMSCs( که می توانند به آسانی به دست آمده و حتی پس از کشت می توانند به غضروف تمایز یابند. محدودیت عمده استفاده از BMSCs برای مهندسی بافت غضروف ، تجمع ماتریکس و خواص مکانیکی سازه های مملو از آنهاست که در مقایسه با سازه های بذرپاشی شده با کندروسیت ها ، کمتر است و همچنین افزایش بیان کلاژن نوع X که یک مارکر کندروسیت های هایپرتروفیک است و همچنین بیان کلاژن نوع I می باشد. . (Kock et al., 2012:2)
سلول های بنیادی مشتق از بافت چربی )ADSCs( نشان داده اند که در سیستم سه بعدی ، در حضور آسکوربات، دگزامتازون و β-TGF قادر به تمایز به کندروسیت ها هستند. . (Kock et al., 2012:2) این جمعیت شبه فیبروبلاستی سلول های بنیادی را می توان از بافت چربی جدا کرد. . (C. Chung & Burdick, 2008:7) قدرت غضروف زایی آنها در مقایسه با BMSCs پایین تر است . علاوه بر مغز استخوان و بافت چربی، از منابع دیگری مانند عضلات، سینوویوم و پریستوم نیز برای اهداف مهندسی بافت غضروف استفاده شده است. . (Kock et al., 2012:2)
-3 مواد مورد استفاده در مهندسی بافت
پلیمرهای طبیعی و مصنوعی زیادی برای ساخت داربست مهندسی بافت استفاده شده که در مجموع ، آنها باید دارای زیست سازگاری، زیست تخریب پذیری، پایداری مکانیکی و چسبندگی بالای سلولی باشند. . (H. J. Chung & Park, 2007:3) در کاربردهای زیست پزشکی ، شیمی مواد، وزن مولکولی، حلالیت، شکل و ساختار، آبدوستی یا آبگریزی، انرژی سطح، تخریب حاصل از جذب آب و مکانیزم فرسایش ، معیارهایی برای انتخاب است. .(Dhandayuthapani et al., 2011:2)
-1-3 پلیمرهایی با منشا طبیعی
جنبه های اقتصادی و زیست محیطی در پلیمرهای طبیعی، همانند زیست تخریب پذیری آنها، سمیت پایین، هزینه های پایین تولید ، هزینه های پایین دسترسی و قابلیت تجدید باعث افزایش علاقه به آنها شده است . علاوه بر این، آنها طیف گسترده ای از مزایا را برای کاربردی های مهندسی بافت مانند سیگنال های زیستی و چسبندگی سلولی را ارائه می دهند. در هر حال ، خطر پس زدن از طریق پاسخ های ایمنی و انتقال بیماری ، غربالگری و تصفیه آنها را ضروری می سازد. .(Puppi et al., 2010:8)
پلیمرهای طبیعی که به طور گسترده برای کاربردهای مهندسی بافت مورد استفاده قرار گرفته اند شامل کربوهیدرات ـ بیس ها ( مانند آلژینات، آگارز، کیتوزان، نشاسته، سلولز، دکستران، هیالورونیک اسید ) و پروتئین ـ بیس ها ( مانند چسب فیبرینی ، کلاژن تیپ I و II
و ابریشم ) هستند. . (Puppi et al., 2010:7) (Izadifar et al., 2012:6) (H. J. Chung & Park, 2007:3) پلی ساکاریدها دارای برخی خواص بسیار خوب مانند غیر سمی بودن، قابلیت تجدید، حلالیت در آب، پایداری نسبت به تغییرات pH ، قابلیت اصلاح شیمیایی برای رسیدن به میزان بالای جذب آب و همچنین زیست ـ عاملدار کردن ، هستند . به هر حال مشکل مواد طبیعی مقاومت مکانیکی ، حرارتی و شیمیایی پایین آنهاست. . (Puppi et al., 2010:10,11)
-2-3 پلیمرهای مصنوعی
پلیمرهای مصنوعی خواص فیزیکی، شیمیایی و تخریب قابل پیش بینی را ارائه می دهند. . (Puppi et al., 2010:17) داربست های پلیمری توجه زیادی را به دلیل خواص منحصر به فرد خود از قبیل نسبت سطح به حجم بالا، تخلخل بالا با منافذ بسیار کوچک، زیست تخریب پذیری و خواص مکانیکی خوب ، به خود جلب کرده اند. . (Dhandayuthapani et al., 2011:2) پلیمرهای سنتزی زیست تخریب پذیری که به طور گسترده برای مهندسی بافت مورد استفاده قرار می گیرند شامل پلی آلفا هیدروکسی استرها، پلی انیدریدها و پلی اورتواسترها هستند. در این میان، پلی آلفا هیدروکسی استرها مانند پلی لاکتیک اسید، پلی گلیکولیک اسید و کوپلیمرهای آن از گسترده ترین مواد مورد استفاده در داربست های زیست تخریب پذیر هستند. . (H. J. Chung & Park, 2007:3) خطرات احتمالی از قبیل سمیت، ایمنی زایی و عفونت برای پلیمرهای مصنوعی خالص تر ، پایین می باشد. با این حال اغلب آنها فاقد نشانه های بیولوژیکی
ذاتی هستند که در بسیاری از مواد طبیعی باعث شروع پاسخ سلولی مطلوب می شود.
-4 طراحی داربست برای مهندسی بافت غضروف
به طور کلی طراحی داربست برای ترمیم غضروف شامل سفارشی سازی خواص بیوشیمیایی و فیزیکی برای مهندسی بهتر سازه های بافت غضروف است . طراحی بیوشیمیایی مربوط به خواص ترکیب شیمیایی و خواص بیولوژیکی داربست است که بطور کلی رفتار و فعالیت سلولی را تحت تاثیر قرار می دهند. طراحی فیزیکی مربوط به معماری داخلی و خارجی داربست، خواص مکانیکی و تخریب آن
است.
-1-4 بک بن داربست
داربست های هیدروژلی ( شبکه های پلیمری بسیار هیدراته) و پلیمری جامد، داربست هایی هستند که به طور گسترده برای مهندسی بافت غضروف استفاده می شوند. . (Izadifar et al., 2012:6) (شکل (2
هیدروژل ها شبکه های جاذب آب، برای ارائه سلول ها و عوامل فعال زیستی بسیار مناسب هستند. . (C. Chung & Burdick, 2008:9 ) هیدروژل را می توان به راحتی تهیه و کندروسیت ها را در آن جاداد. . (Izadifar et al., 2012:6) از مهمترین ویژگی های هیدروژل ها حفظ فنوتیپ کروی کندروسیت ها ، عدم از دست دادن تمایز سلول های محصور شده (Kock et al., 2012:4) و همچنین ترویج مهاجرت سلولی و انتشار سریع مواد غذایی می باشد. . (Dhandayuthapani et al., 2011:7) هیدروژل را می توان از زیست موادی از جمله مواد طبیعی و همچنین مواد مصنوعی مانند پلی هیدروکسی اتیل متاکریلات ، پلی اتیلن گلیکول و مشتقات آن و یا پلی وینیل الکل و... تهیه کرد. . (Izadifar et al., 2012:6) آنها می توانند به شکل مایع و قابل تزریق که به خوبی با کندروسیت ها مخلوط شده اند، طراحی شوند. . (Kock et al., 2012:4 ) با این حال، هیدروژل خواص مکانیکی بسیار ضعیفی دارد. کنترل محدود بر شکل و ساختار درونی موضوع دیگری که طراحی معماری داربست هیدروژل را دشوار می کند. . (Izadifar et al., 2012:6)
داربست جامد به طور کلی از مواد مصنوعی زیست سازگار ساخته شده و دارای خواص بیومکانیکی برتری نسبت به هیدروژل هاست. علاوه بر این، این مواد اجازه ساخت آسان تر داربست با شکل ها و معماری داخلی دلخواه را فراهم می کنند. برخی پلیمرهای مصنوعی شامل پلی گلیکولیک اسید )PGA( ، پلی لاکتیک اسید )PLA( ، پلی لاکتیک اسید ـ گلیکولیک اسید )PLGA( ، پلی کاپرولاکتون )PCL( و پلی اتیلن گلیکول )PEG( ، به دلیل قابلیت زیست تخریب پذیری شان و تاییدیه سازمان غذا و داروی ایالات متحده )FDA(، بسیار در مهندسی بافت غضروف مورد استفاده قرار گرفته اند. . (Kock et al., 2012:4) ( Izadifar et al., 2012:6) علی رغم پایداری مکانیکی مناسب داربست های جامد برای مهندسی بافت غضروف ، این داربست ها تمایل کمتری برای فعالیت و چسبندگی سلولی نسبت به هیدروژل نشان داده اند. روش های مختلفی برای بهبود چسبندگی سطحی سلول ها و زیست فعالی پلیمرهای مصنوعی وجود دارد ، از آن جمله می توان ترکیب و یا کوپلیمربزاسیون مواد آبدوست / آبگریز مانند کیتوزان ، پلی متاکریلیک اسید ، فیبرونکتین ، کلاژن و مولکول های کندرویتین سولفات را نام برد. انواع داربست جامد شامل داربست های اسفنجی متخلخل ، فیبری (بافته شده و بافته نشده) هستند. (شکل (3
