بخشی از مقاله
-1چکیده:
در این مطالعه به ساخت، ارزیابی و مقایسه دو نوع داربست پلی هیدروکسی بوتیرات /کیتوسان با الیاف جهت دار و راندوم برای کاربرد در مهندسی بافت غضروف پرداختهشد. با مخلوط کردن پلیهیدروکسی بوتیرات به مقدار 11درصد وزنی وکیتوسان به میزان 0و 15و25 درصد وزنی در حلال تریفلورواستیک اسید، محلول پلیمری ساخته شد. درنهایت، محلول بهدستآمده بهصورت راندوم و جهت دار الکتروریسی شد. داربستهای ساختهشده توسط میکروسکوپ الکترونی روبشی - SEM - ، آزمون زاویهتماس با آب - WCA - ، تست کشش، مورد ارزیابی قرار گرفتند. تصاویر میکروسکوپ الکترونیروبشی نشان داد که قطر متوسط الیاف جهتدار و راندوم با افزایش کیتوسان، افزایش می یابد. همچنین نتایج حاصل از آزمون زاویه تماس با آب نشان داد که با افزایش کیتوسان و آرایش الیاف، آبدوستی بیشتر میشود. نتایج آزمون کشش نشان داد که داربست آلیاژی آرایشیافته با 15 درصد کیتوسان خواص مکانیکی بهینه را دارد - 7/83 مگا پاسکال - . این مطالعه نشان داد که با جهت بندی الیاف در داربست آلیاژی پلیهیدروکسیبوتیرات-کیتوسان، خواص فیزیکی، مکانیکی نسبت به ساختار راندوم بهبود پیدا میکند که این موضوع برای مهندسی بافت غضروف بسیار مناسب است.
کلید واژهها: پلیهیدروکسی بوتیرات، کیتوسان، الیاف جهتدار، الکتروریسی، داربست
-2مقدمه
مهندسی بافت غضروف1 یکی از امیدوارکننده ترین روشها برای درمان ضایعات غضروفی می باشد. مهندسی بافت در سیستم غضروفی محیطی حاصل تلاش پزشکان، مهندسین و بیولوژیستها است که با استفاده از مواد طبیعی و سنتزی یا به کمک غضروف جهت جانشینی برای اتوگرافت2 مورد توجه قرار گرفته. امروزه سلول درمانی به کمک مهندسی بافت در درمان بسیاری از بیماریهای غضروفی استفاده می شود - . - 4 در واقع، داربست3های بکار رفته در مهندسی بافت یک ساختار سه بعدی دارند که بستر مناسبی برای رشد سلولها فراهم میکنند. این داربستها باید زیست سازگار و دارای خواص مکانیکی مطلوب باشند؛ بطوریکه توانایی تحمل نیروها را داشته و رفتاری مشابه بافت مورد نظر در برابر تنشها داشته باشند. علاوه بر این داربست ها باید نرخ تخریب کنترل شده، اندازه و آرایش و مورفولوژی تخلخل مناسب جهت رشد طولی سلولی و قابلیت استریل شدن و پیوند زدن مناسب و مطلوب داشته باشند تا بتوانند در مهندسی بافت مورد استفاده قرار گیرند. از مزایای مهندسی بافت کاهش تعداد عملهای مورد نیاز و بهبود سریعتر بیمار می باشد - . - 4
مطالعات نشانداده است که لامینین4، کلاژن5، فیبرونکتین6 و بسیاری از پروتئوگلیکان7 ها و گلیکوزآمینوگلیکان8 ها و مواد زمینه ای خارج سلولی سبب تعدیل فعالیت غضروفی می شوند، موادی مانند هیالورونیک اسید9، فیبرینوژن10، ژل های فیبرینی، آلژینات11، آگارز12 و کیتوسان13 در ترمیم ضایعات غضروفی بکار برده شدهاند - . - 4 همچنین تحقیقات فراوانی بر روی داربستهای مصنوعی جهت ترمیم غضروفی استفاده شدهاست. تعدادی از مواد سنتزی که جهت کمک در ترمیم غضروف مؤثر هستند عبارت اند از: پلی هیدروکسی آلکانوات14ها - PHA - از خانواده پلی استرهای آلیفاتیک میکروبی خاصیت زیست سازگاری و زیست تخریب پذیری دارند نوع پلیمرها منجر به ایجاد خواص فیزیکی، مکانیکی و سرعت تخریب متفاوت در محیطهای بیولوژیکی شدهاست.
از پلیمرهای معروف و تجاری این دسته از مواد می توان به پلی هیدروکسی بوتیرات15 اشاره کرد که از ساده ترین و معمولترین پلیمرهای خانواده PHA به شمار میرود. پلیهیدروکسی بوتیرات دارای سمیت کمی است، که تا حدودی میتواند به این علت باشد که ماده در محیط درون تن به D-3 هیدروکسی بوتیرا ت که یکی از اجزای طبیعی خون است، تخریب میشود. قابل ذکر است که پلیمر پلیهیدروکسی بوتیرات در مقایسه با سایر پلیمرها از خواص مکانیکی بالاتری برخوردار است. اما در کنار مزایایی که این پلیمر از خود نشان میدهد، معایبی نظیر آب دوستی و نرخ تخریب پایینی دارد و ماده تردی به شمار میرود. به منظور رفع این محدودیت ها، از ترکیب این پلیمر با سایر پلیمرها استفاده میشود.
پلیمرهای کیتین و کیتوسان ، آمینو پلی ساکاریدهای طبیعی هستند که کاربردهای وسیعی در زیست پزشکی و دیگر حوزههای صنعتی دارند. همان طور که در شکل مشاهده میشود، هنگامی که تعداد واحدهای- N استیل گلوکوزامین بیش از % 50 باشد به این بیوپلیمر کیتین و هنگامی که تعداد واحدهای N-5 گلوکوزآمین در آن بیش از % 50 باشد به آن کیتوسان می گویند. کیتوسان مادهای زیست سازگار است که می تواند توسط آنزیمهای متعددی تخریب شود و محصولات تخریب آن الیگوساکاریدهایی با طولهای مختلف هستند که سازگار با بدن میباشند. کیتوسان دارای سطحی آب دوست است. به همین دلیل چسبندگی سلولی و تکثیر و تمایز، سلولی را افزایش میدهد. علاوه بر این، کیتوسان دارای فعالیت ضد باکتری است و حداقل واکنش را با بافت میزبان از خود نشان میدهد در نتیجه باعث عدم عفونت در محل کاشته شده میشود.
با استفاده از کیتوسان میتوان داربستهایی با ساختارهای متخلخل، با تخلخلهایی به هم مرتبط، برای کاربردهای مهندسی بافت ایجاد کرد. اما کیتوسان از لحاظ مکانیکی به شدت ضعیف و ناپایدار است. به همین دلیل برای افزایش و بهبود خواص مکانیکی یا بیولوژیکی آن، استفاده از مواد بیولوژیکی فعال دیگر مانند هیدروکسی آپاتیت16 ، کلاژن یا ژ لاتین17 در ترکیب با کیتوسان توسعه یافته است. برای بهبود خواص فیزیکی، مکانیکی، بیولوژیکی و ... داربست میتوان از ترکیب پلیمرهای مصنوعی و طبیعی، یا روش های مختلف ساخت، یا هردو بهره برد. هدف از انجام این پژوهش، ساخت داربست مناسب با الیاف جهتدار بمنظور کاربرد در مهندسی بافت عصب است. پس از آمادهشدن داربستها، مورفولوژی، قطر الیاف ، میزان تخلخلها با استفاده از تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی18 محاسبهشد. بعد از آن آزمونهای کشش19 و زاویهی تماس20، تست تخریب21 و کشت سلولی22 روی داربستها انجام شد.
-3مراحل ساخت
-1-3تولید محلول پلیمری
ابتدا باید عوامل تاثیرگذار بر خواص داربستها نظیر غلظت، ولتاژ و فاصله تعیین و بهینه سازی شود. با توجه به مطالعات قبلی که روی غلظت محلول، ولتاژ اعمالی و نسبت حلال برای ساخت داربست به روش الکتروریسی صورت گرفت، محلول پلیمری پلی هیدروکسی بوتیرات کیتوسان با استفاده از حلال تری فلورواستیک اسید دردمای 45 درجه سانتی گراد و با غلظت% 11 وزنی و0 ، 15 ،و % 25 کیتوسان در زمان 55 دقیقه تهیه شد. سپس محلول پلیمری تهیه شده با نرخ 15 میلی لیتر بر ساعت و فاصله 15 سانتی متر تا جمع کننده و ولتاژ 210ولت الکتروریسی شد.
-2-3 ساخت داربست
به این منظور از دستگاه الکتروریسی که شامل یک پمپ سرنگی برای تزریق محلول پلیمر و یک منبع تولید ولتاژ قوی بین صفحه جمع کننده و پمپ تغذیه می باشد، استفاده شد. سوزن سرنگ به جریان ولتاژ و الکترود بعدی به سطح ورقه آلومینیومی متصل گردید. سرعت تزریق محلول برابر1 میلی لیتر در ساعت تنظیم شد و بین سوزن و جمع کننده، ولتاژ قوی21 کیلو ولت ایجاد شد. نانو الیاف تشکیل شده، بر روی ورق آلومینیومی که در فاصله 15 سانتیمتری از نوک سوزن قرار داشت و جمع کننده در حال حرکت با سرعت 1500rpmجمع آوری شد. پمپ تزریق افقی قرار گرفته، و سپس به سرسرنگ انسولین وصل و در نهایت جهت القای بار به محلول درون سرنگ، قطب مثبت منبع تغذیه را بدان وصلکرده و در روبروی سرنگ نیز ورقه ای از فویل آلومینیوم بر روی جمعکننده که با سرعت 1500rpmدر حال چرخش است، قرار داده و قطب منفی منبع تغذیه به آن وصلشد. قبل از اتصال جریان مشاهدهشد که سیال به کمک نیروی جاذبه به شکل قطره در میآید، ولی پس از وصل جریان نیروی حاصله از رانش بارهای ناهمنام بر نیروی کشش سطحی فائق آمده، قطره در طول مسیر کشیده شده و سپس به صورت یک جت در میآید. نمونه هایی با آرایش جهتدار با 0 ، 15 و % 25 کیتوسان الکتروریسی شد.
-3-3 میکروسکوپ الکترونی روبشی
در این تحقیق بهمنظور بررسی مشخصات ساختاری داربست های پلیمری نظیر درصد تخلخل، نحوه توزیع تخلخلها و ارتباط آنها با یکدیگر و مورفولوژی، یکنواختی و قطر الیاف، از میکروسکوپ الکترونی روبشی - SEM - استفاده شد. بهاینترتیب که در ابتدا نمونهها در قطعاتی با ابعاد 1 * 1 آماده و بریده شده و با روکش طلا پوشیده شدند. سپس برای تصویر برداری در دستگاه SEM قرار داده شدند.
-4-3 بررسی خواص مکانیکی
اندازهگیری دقیق خواص مکانیکی داربستها برای کاربردهای پزشکی ضروری است زیرا به این روش می توان میزان تحمل نمونه در برابر نیروهای وارده را در طی عمل جراحی، وبعد از آن را تضمین نمود. از همین رو به واسطهی آزمون کشش تک محوره بر روی الیاف اطلاعات متنوعی از جمله مدول یانگ - شیب نمودار تنش- کرنش - ، تنش تسلیم - قطعه ی انتهایی ناحیه ی خط الاستیک و آغاز ناحیه ی غیر خطی پلاستیک - تنش شکست و نیز، انرژی شکست - سطح زیر نمودار تنش کرنش - را میتوان به دست آورد. برای انجام این آزمون بر روی نمونه های مذکور توسط دستگاه با دو بار تکرار، سرعت آزمون 50 میلی متر بر دقیقه و طول نمونه 3 سانتی متر استفاده شد.
-5-3 اندازه گیری زاویه تماس با قطره آب
اندازهگیری زاویه تماس آب میتواند نشاندهنده میزان آبدوستی سطوح نمونه باشد که با استفاده از تکنیک قطره چسبیده و با کمک زاویهسنج زاویه تماس مشخصهیابی شد. زاویه تماس از طریق محاسبه میانگین زاویه تماس حداقل هشت قطره آب بر روی مناطق تصادفی
