بخشی از مقاله
مقدمه:
به طور کلی مهندسی بافت عضله اسکلتی از سلول هاي پیشروي مولد رشته هاي عضلانی و داربست ها استفادهمی کند تا محیط مناسبی براي ترمیم، جایگزینی یا بازتولید بافت از بین رفته یا آسیب دیده ایجاد کند. این داربست ها نقش ماتریکس خارج سلولی بافت طبیعی را بازي می کنند و بایستی از رشد و تمایز سلول هاي پیشرو حمایت کنند. از طرفی بافت عضله اسکلتی کارآمد نیازمند آرایش موازي فیبرهاي عضلانی داراي فیلامنت هاي میوزین/اکتین می باشد. الکتروریسندگی روش سریع و کارآمدي است که امکان ساخت داربست هاي نانوفیبري منظم از پلیمرهاي زیست سازگار را فراهم می آورد.
هدف: ساخت داربست هاي نانوفیبري منظم و نامنظم ویژه سلول هاي عضلانی و بررسی زیست سازگاري آنها. روش: در این مطالعه بعد از به دست آوردن شرایط اپتیمم مؤثر در فرایند الکتروریسی پلیمرهاي پلی کاپرولاکتون/پلی گلیکولیک اسید و پلی کاپرولاکتون/کلاژن داربست هاي نانوفیبري منظم و نامنظم از پلیمرهاي مورد نظر با تکنیک الکترو ریسی ساخته شدند و با آزمون هاي مختلف ارزیابی و مقایسه شدند. نتیجه تحقیق: یافته هاي حاصل در این مطالعه نشان دادند که به طور کلی هر دو ترکیب قابلیت الکتروریسی منظم را دارند. در آزمون هایی که به منظور بررسی برهم کنش هاي این داربست ها با سلول هاي فیبروبلاست انسانی و میوبلاست رت انجام شد، همه داربست ها زیست سازگاري مطلوبی در تست MTT نشان دادند.
کلمات کلیدي: الکتروریسی، نانوفیبرهاي منظم، سلول هاي فیبروبلاست انسانی، سلول هاي میوبلاست رت
مقدمه:
براي تقلید از آرایش بیوشیمیایی و توپوگرافی ماتریکس خارج سلولی، داربست هاي نانوفیبري با استفاده از پروتئین ها و پلی ساکاریدهاي ماتریکس خارج سلولی و نیز فرمولاسیون هاي مصنوعی که با خصوصیات فیزیکی آنها منطبق باشند، تهیه شده اند. الکتروریسندگی امکان تهیه ساختمان هاي منظم و منحصر به فردي از پلیمرها را فراهم می کند که شبیه ساختار متخلخل بافت طبیعی است. علاوه براین الکتروریسندگی تکنیک متعادلی است که پروتئین ها و سایر ماکرومولکول هاي الکتروریسی شده را تجزیه و یا مجتمع نمی کند. علاوه بر الگوبرداري از محیط بیوشیمیایی و ساختمانی، هر سیستم بافتی معینی ویژگی هاي خاص خودش را هم دارد. ثابت شده است که مخلوط هاي پلی کاپرولاکتون-کلاژن استحکام و الاستیسیتی مناسبی براي مقابله با استرس طولانی مدت دارند، بنابراین براي اینکار مناسب هستند . - 1 -
ماهیچه اسکلتی %48 از وزن بدن را تشکیل می دهد و نقش مهمی در کنترل حرکات ارادي بدن دارد. ماهیچه اسکلتی به طور عمده از میوتیوب هاي چند هسته اي مخطط تشکیل شده است. آرایش میوتیوب ها که به صورت ردیف هاي موازي با یک محور مشترك می باشد به آنها قابلیت لازم براي حرکت بدن را می دهد. در بسیاري از موارد از دست دادن انسجام ماهیچه به دلیل دیستروفی هاي عضلانی ارثی، تصادفات، یا خارج نمودن تومورهاي بافتی منجر به آسیب هاي غیرقابل ترمیم عملکرد مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی می شود. بنابراین ضرورت توسعه مهندسی بافت عضله اسکلتی به منظور تقلید سازمان یابی سلولی و عملکرد فیزیولوژیک ماهیچه اسکلتی براي ترمیم و جایگزینی ماهیچه آسیب دیده کاملاً احساس می شود.مطالعات نشان داده که میوبلاست ها و میوتیوب هاي اسکلتی می توانند در جهت نانوفیبرها آرایش یابند . - 2 -
یک داربست ایده آل در مهندسی بافت، خصوصیات بیوشیمیایی بافت هدف را دارد و با فراهم نمودن چسبندگی سلولی، رشد، مهاجرت، تمایز و پایداري فنوتیپ هم براي سلول هاي درون زا و هم سلول هاي پیوندي، نقش میزبان را ایفا می کند. ظهور نانوفناوري امکانات فراوانی را براي تولید شرایط مشابه ریزمحیط طبیعی سلول ها فراهم نموده است . - 3 - داربست هاي نانوفیبري براي چنین هدفی بسیار مناسب هستند، چون ابعادي مشابه اجزاء ماتریکس خارج سلولی دارند و ساختمان فیبري آنها را تقلید می کنند، بنابراین براي سازمان یابی، حیات و عملکرد سلولی مناسب هستند. الکتروریسندگی روش سریع و قابلی براي ساخت داربست هاي نانوفیبري می باشد.داربست هاي نانوفیبري در عین حال که ذاتاً تخلخل و نسبت سطح به حجم بالایی دارند، داراي خصوصیات توپوگرافی بسیار متنوعی نیز هستند که مشوق چسبندگی و تکثیر سلولی است.
علاوه براین تنوع ساختارها در داربست ها عملکرد سلولی را تحت تأثیر قرار می دهد . - 4 - براي مهندسی بافت ماهیچه اي عملکردي، داربست هایی مناسب هستند که اجازه سازمان یابی فیبرهاي هم سو را با بیشترین شباهت با انواع طبیعی بدهند . - 5 - پلی کاپرولاکتونیک پلیمر بسیار الاستیک نسبتاً ارزان است که سمیت نداشته و به آرامی تجزیه میشود 2-1 - سال - . دلیل انتخاب پلی کاپرولاکتون، خصوصیات خوب مکانیکی - مدول و الاستیسیتی - و سرعت پایین تجزیه می باشد . - 6 - اما آبدوستی ضعیف آن باعث کاهش توانایی چسبندگی، مهاجرت، تکثیر و تمایز سلول ها می شود . - 7 - ایجاد پوشش با کلاژن محلول، جذب سلولی قابل قبولی را سبب می شود . - 6 -
در ماتریکس بین سلولی طبیعی، کلاژن از اجزاء ساختمانی اصلی محسوب می شود و در یک ساختار شبکه اي سه بعدي، از فیبرهایی در مقیاس نانو تشکیل شده است. کلاژن داراي ویژگی هاي مناسبی است مثل منشأ زیستی، ایمونوژن نبودن و زیست سازگاري و زیست تخریب پذیري بسیار عالی . - 8 - فاکتور کلیدي در الکتروریسی کلاژن شناسایی حلالی است که کلاژن را به خوبی در غلظت هاي مناسب حل کند و به اندازه کافی فرار باشد. داربست هاي کلاژن الکتروریسی شده به دلیل شباهت بسیار به شبکه کلاژنی ذاتی براي پوشش هاي زخمی و مهندسی اولیه بافت عروقی مورد استفاده قرار گرفته اند . - 9 -
پلی گلیکولیک اسید یک پلی استر آلیفاتیک زیست تخریب پذیر می باشد که کاربردهاي پزشکی متنوعی دارد. سرعت تجزیه تک رشته هاي آن در محیط درون تنی به دلیل طبیعت آب دوستش، 2 تا 4 هفته می باشد. به دلیل تجزیه آبی آن، حدود 60 درصد از قدرتش را طی دو هفته اول از دست می دهد و pH و کریستالینیتی موضعی آن کاهش سریعی پیدا می کند. هر زمان که به ماده اي با سختی اولیه - قدرت و الاستیسیتی بالا - و تجزیه سریع نیاز داشته باشیم، پلی گلیکولیک اسید انتخاب مناسبی است . - 6 - در این مطالعه بعد از به دست آوردن شرایط اپتیمم مؤثر درفرایند الکتروریسی پلیمر هاي پلی کاپرولاکتون/پلی گلیکولیک اسید و پلی کاپرولاکتون/کلاژن داربست هاي نانوفیبري منظم و نامنظم از پلیمرهاي مورد نظر با تکنیک الکتروریسی ساخته و با آزمون هاي مختلف ارزیابی و مقایسه شدند.
مواد و روشها:
-1 الکتروریسی تهیه محلول ها به صورت وزنی/حجمی صورت گرفت. سهم پلی کاپرولاکتون 75 درصد و سهم پلی گلیکولیک اسید - و کلاژن - 25 درصد در نظر گرفته شد. این شیوه براي همه نمونه ها اعمال شد و پلیمرهاي پلی کاپرولاکتون/ پلی گلیکولیک اسید و پلی کاپرولاکتون/ کلاژن به حلال هگزافلوروایزوپروپانول اضافه شده و به مدت 24 ساعت روي همزن مغناطیسی با سرعت 350 دور در دقیقه هم زده شدند. بعد از پر شدن سرنگ از محلول پلیمري، سرنگ در محل خاص خود قرار گرفت به نحوي که از یک طرف پیستون آن تحت کنترل پمپ تزریق قرار می گرفت و از طرف دیگر از طریق شلنگ پلی اتیلن به سوزن متصل بود و سوزن نیز به نوبه خود از طریق سیم به سیستم تأمین کننده ولتاژ بالا دستگاه الکتروریس متصل می شد. براي تولید نانوفیبرها در طول فرایند الکتروریسی، با روشن شدن دستگاه و سیستم تأمین کننده ولتاژ بالا، اختلاف ولتاژ لازم بین سرسوزن فلزي و صفحه جمع کننده با روکش ورقه آلومینیمی متصل به زمین - بار الکتریکی صفر - برقرار می شد.
صفحه جمع کننده در واقع یک استوانه چرخان - درام - است که با ورقه آلومینیومی پوشیده می شود.هدف اصلی در این تحقیق تولید داربست هاي نانوفیبري منظم براي سلول هاي عضله اسکلتی می باشد. براي تحقق این هدف از درام چرخان با سرعت بالا استفاده شد 3200 - دور در دقیقه - . سرعت بالاي درام باعث تشکیل نانوفیبرها با آرایش موازي - منظم - می شود. ورق آلومینیمی پوشش یافته با نانوفیبرها از نقاط مختلف - در تکه هاي کوچک 3 3 میلیمتري - بریده شد و تکه ها با چسب کربنی روي نگهدارنده نمونه در SEM چسبانده شدند. پس از 3 دقیقه پوشش دهی با طلا به وسیله دستگاه پوشش دهنده طلا، مورفولوژي نانوفیبرهاي به دست آمده، با دستگاه میکروسکوپ الکترونی روبشی بررسی شدند. ولتاژ اعمالی 19 - کیلوولت - ، نرخ تزریق 1 - میلی لیتر در ساعت - ، نوع سرنگ 2/5 - میلی لیتري - ، قطر سوزن - Gauge 25 - ، دما 37 - درجه ي سانتی گراد - و رطوبت محیط براي همه نمونه ها ثابت و یکسان اعمال شد.
-2 بررسی زیست سازگاري داربست هاي نانوفیبري پلی کاپرولاکتون / پلی گلیکولیک اسید و پلی کاپرولاکتون / کلاژنابتدا از داربست ها عصاره گیري شد. براي این کار، داربست ها به مدت زمان 3، 7 و 14 روز در مجاورت محیط کشت RPMI - Rosewell Park Memorial Institute - قرار گرفتند. به ازاء هر سانتی متر مربع از داربست، 1 میلی لیتر محیط کشت RPMI بدون - Fetal Bovine Serum - FBS به لوله فالکون 15 میلی لیتري حاوي داربست اضافه شد. همچنین یک لوله فالکون حاوي محیط کشت بدون داربست به عنوان کنترل منفی در نظر گرفته شد. لوله هاي فالکون در انکوباتور 37 درجه ي سانتی گراد قرار داده شدند. سپس عصاره ها با سلول هاي فیبروبلاست انسانی مجاور شدند. بعد از اتمام هر مرحله از عصاره گیري 3 - ، 7 و 14 روز - ، عصاره ها در مجاورت سلول ها قرار گرفتند.
24 ساعت قبل از مجاور نمودن عصاره و سلول ها، سلول هاي فیبروبلاست در پلیت هاي 96 خانه اي کشت داده شدند 104 - سلول در 100 میکرو لیتر محیط کشت در هر خانه مورد آزمایش - . بعد از 24 ساعت و حصول اطمینان از رشد سلول ها، محیط کشت از خانه ها خارج شده و با 100 میکرو لیتر از عصاره داربست مورد نظر جایگزین شد. سپس پلیت ها به مدت 24 ساعت دوباره در دماي 37 درجه، 5 CO2 درصد انکوبه شدند. بعد طی زمان مورد نظر - 3، 7 و 14 روز - ، عصاره ها خارج شده و با 100 میکرو لیتر ماده شیمیایی 3- - 4, 5- - MTT - dimethylthiazol-2-yl - -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide - با رقت 0/5 میلی گرم پودر MTT در 1 میلی لیتر - PBS جایگزین شدند، سپس به مدت 4 ساعت در دماي 37 درجه ي سانتی گراد و 5 CO2 درصد انکوبه شدند . بعد از این مدت ایزوپروپانول جاي MTT را گرفت تا کریستال هاي آبی رنگ و نامحلول فورمازان در آن حل شود - به همان میزان 100 میکرو لیتر - و 20 دقیقه دیگر انکوباسیون ادامه یافت. بعد از این مرحله پلیت ها 5 دقیقه تکان داده شدند و جذب نوري چاهک
