بخشی از مقاله
چکیده
به منظور بررسی تاثیر تنش شوری بر تظاهر ژنهای دخیل در سنتز پرولین در ژنوتیپهای حساس و متحمل به شوری گیاه جو، آزمایشی بهصورت فاکتوریل در قالب طرح بلوکهای کامل تصادفی با 3 تکرار در گلخانه دانشگاه آزاد اسلامی واحد اردبیل در سال 1395 اجرا گردید که در آن فاکتور اول شامل 6 ژنوتیپ جو متحمل و حساس - شامل افضل، نصرت و صحرا به عنوان متحمل و والفجر، کویر و دشت به عنوان حساس - و فاکتور دوم شامل 4 سطح شوری - صفر به عنوان شاهد و تنش شوری 6، 12و 18 دسیزیمنس بر متر - بود.
نتایج حاصل نشان داد که بین سطوح تنش شوری اختلاف معنیداری در سطح احتمال 5 درصد وجود دارد، بهطوری که با افزایش سطح شوری از 6 به 12 دسی زیمنس بر متر ، بیان نسبی ژن افزایش و سپس با افزایش شدت تنش به 18 دسی زیمنس بر متر ، بیان ژن دچار کاهش شد. همچنین، نتایج نشان داد که اثر تنش شوری بر بیان نسبی ژن پرولین کربوکسیلات سینتاز - P5CS - معنیدار بود. اختلاف بین ارقام نیز از لحاظ بیان نسبی ژن پرولین کربوکسیلات سینتاز - P5CS - معنیدار گردید بطوریکه ارقام متحمل افضل، نصرت و صحرا دارای بیان نسبی بالا و ارقام حساس والفجر، کویر و دشت بیان ژنی کمتری داشتند.
مقدمه
شوری یکی از گستردهترین تنشهای خسارتزای مناطق خشک و نیمهخشک است و به عنوان یک تنش غیرزنده اختلالات بسیاری را در فرآیندهای زیستی ایجاد مینماید .[1] اگر کشاورزی در خاکهای شور ادامه یابد، گیاهان زراعی نیاز خواهند داشت تا تحمل آنها به تنش شوری افزایش یابد. برای افزایش مقاومت به شوری نیازمند شناسایی مکانیسم های تحمل شوری، منابع ژنتیکی جدید و تکنیکهای موثرتر برای شناسایی ژرمپلاسم متحمل به شوری هستیم
موفقیت در شناسایی ژنهای دخیل در تنش شوری موجب کمک به اصلاح ژنتیکی برای افزایش توانمندی گیاه در مواجهه با تنش و تولید محصول میباشد. درک مکانیسمهایی که گیاهان به هنگام مواجهه با تنش به کار میبرند، کمک شایان توجهی به محققین اصلاحگر خواهد کرد. برای طراحی برنامه اصلاحی مناسب برای توسعه واریتههای متحمل به شوری، اطلاعات روی پایه ژنتیکی تحمل به شوری، طریقه توارث، درجه اهمیت تاثیرات ژن و طریقه عمل آنها ضروری است.
وقتی تعدادی از گیاهان آوندی مانند جو تحت تنش شوری یا خشکی قرار میگیرند با افزایش تجمع اسمولیتهایی مانند پرولین به این تنشها پاسخ میدهند. سنتز پرولین توسط آنزیمهای پرولین- -5 کربوکسیلات سینتاز - P5CS - و پرولین- -5 کربوکسیلات ردوکتاز - P5CR - انجام میگیرد .[4] بنابراین، با مطالعه تاثیر سطوح تنش شوری بر تظاهر ژنهای سنتزکننده اسمولیتهای سازگار در ژنوتیپهای حساس و متحمل به شوری میتوان سهم مکانیسم تحمل بافتی را در ایفای تحمل به تنش شوری مشخص کرد.
مواد و روش ها
آزمایش در گلخانه دانشگاه آزاد اسلامی واحد اردبیل بهصورت فاکتوریل در قالب طرح بلوکهای کامل تصادفی با 3 تکرار در سال 1395 اجرا گردید که در آن فاکتور اول شامل 6 ژنوتیپ جو متحمل و حساس - شامل افضل، نصرت و صحرا به عنوان متحمل و والفجر، کویر و دشت به عنوان حساس - و فاکتور دوم شامل 4 سطح شوری - صفر به عنوان شاهد و تنش شوری 6، 12و 18 دسیزیمنس بر متر - بود .اعمال تنش از ابتدای کاشت و اندازهگیری میزان بیان ژنها در فاز زایشی و بعد از ظهور سنبله انجام گرفت.
برای انجام ارزیابی رفتار جوانهزنی، 25 عدد بذر از هر تیمار در داخل پتریدیشهای شیشهای - با قطر 90 میلیمتر - بین دو لایه کاغذ صافی قرار داده شد و 10 میلیلیتر آب مقطر یا محلول NaCl به هر پتری دیش اضافه گردید. پس از پودر کردن بافت برگهای برداشت شده در ازت مایع، mRNA آنها با استفاده از ترایزول استخراج و کتابخانه cDNA به کمک کیت cDNA سنتتاز ساخته و میزان بیان ژنهای مربوط به پرولین کربوکسیلات سینتاز - P5CS - و پرولین کربوکسیلات ردوکتاز - P5C5 - در شرایط مختلف شوری در ارقام جو با روش کمی و با استفاده از Real Time PCR بر اساس روش SYBR Green اندازهگیری شد.
برای استخراج RNA نیز از ترایزول استفاده شد. پس از استخراج mRNA، کیفیت و کمیت آن با روش اسپکتروفتومتری - نانودراپ - و الکتروفورز ژل آگارز بررسی گردید. توالی mRNA مربوط به ژنهای مربوط به پرولین کربوکسیلات سینتاز - P5CS - و پرولین کربوکسیلات ردوکتاز - P5C5 - از سایت NCBI برای جو انتخاب شد. برای طراحی پرایمر از نرمافزار تحت وب Primer3 استفاده شد. سپس کتابخانه cDNA به کمک کیت cDNA سنتتاز ساخته و خلوص cDNA سنتز شده با استفاده از تفکیک بارگذاری روی ژل آگاروز نیم درصد تعیین شد. به منظور سنجش کمی میزان بیان ژن از
روش
Quantitative Real-Time PCR استفاده شد. به منظور سنجش کمی ژن با استفاده از SYBR-Green Real Time PCR از کیت SYBR green Real Time PCR استفاده شد. واکنش تکثیر و آنالیز اطلاعات توسط دستگاه کوربت انجام شد. طبق دستورالعمل کیت، واکنش تکثیری در حجم 20 میکرولیتر شامل10 میکرولیتر از محلول اصلی - Master Mix - ، 0/7 میکرولیتر پرایمر - RUZDUG و 0/7 میکرولیتر پرایمر 5HYHUVH و 1 میکرولیتر F 1$ و 7/6 میکرولیتر آب - 3& میباشد.
از ژن 2GAPDH به عنوان ژن رفرنس، برای نرمال کردن مقادیر کمی mRNA در نمونههای مورد مطالعه استفاده شد. واکنش نسخهبرداری معکوس در دمای 50 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه، تکثیر با آنزیم Taq Polymerase شامل شروع داغ - Hot start - در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه و سپس 45 چرخه شامل: 95 درجه سانتیگراد به مدت 10 ثانیه، 50 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه، 72 درجه سانتیگراد به مدت 35 ثانیه انجام شد و در انتهای چرخههای تکثیر، منحنی دمای ذوب به منظور بررسی اختصاصی بودن قطعه تکثیر یافته رسم شد.
بعد از چندین مرحله واکنش PCR در دستگاه Real Time، الگوی زمانی و غلظتی مشابه بالا به دست آمد که برای حصول اطمینان از عدم حضور باندهای غیراختصاصی از پروسه Melting Curve دستگاه و هم چنین از الکتروفورز در ژل آگارز %1/5 استفاده شد. با استفاده از رنگ سایبرگرین - SYBR Green - میزان تکثیر - Amplification - در هر چرخه دنبال شد.
در چرخهای که واکنش تکثیر وارد مرحله لگاریتمی میشود و تحتعنوان CT - Threshold cycle - گفته میشود، مقدار محصول تکثیر اندازهگیری میشود. پس از اتمام واکنش تکثیر، برای هر واکنش PCR یک نمودار رسم و سپس بر اساس آن CT تعیین شد. برای تعیین خط برش و به منظور مشخص کردن CT نمونههای مورد مطالعه، ابتدا نمونه استاندارد cDNA مربوط به ژن 2GAPDH با غلظتهای سریالی تهیه شد. با استفاده از مدل
رگرسیونی و میزان ضریب تبیین R2 در مدل برازش شده خط برش ترسیم شد و با توجه به خط برش CTها محاسبه شدند.
CT از طریق استانداردکردن CT هر نمونه با CT نمونه اکتین محاسبه و مورد آنالیز آماری قرار گرفت. برای تجزیه و تحلیل دادههای مربوط به بیان ژنهای موردبررسی از روش تجزیه واریانس، مقایسه میانگینها به روش دانکن و بررسی روابط بین بیان نسبی ژنها و مقاومت به شوری از تجزیه رگرسیون و تجزیه همبستگی استفاده شد.برای بررسی بیان نسبی ژنها ابتدا پرایمرهای مورد استفاده طراحی گردید؛ بدین ترتیب که ابتدا توالی mRNA ژن موردنظر را از NCBI پیدا کرده و بوسیله نرمافزار تحت وب primer3 طراحی شد. پرایمرهای مورد استفاده در اندازهگیری بیان نسبی ژنها در جدول 1 ، 2 و 3 آورده شده است.
جدول :1 پرایمرهای مورد استفاده برای ژن پرولین کربوکسیلات ردوکتاز - P5CR -
جدول:2 پرایمرهای مورد استفاده برای ژن پرولین کربوکسیلات سینتاز - P5CS -
قطعاتی که هرکدام از پرایمرهای ذکرشده در جدول 1 و 2 تکثیر میکنند حدود 200 جفتباز میباشد.
جدول :3 پرایمرهای مورد استفاده برای ژن تیوبولین بعنوان ژن خانه دار
برنامه دمایی- زمانی تکثیر ژنها پس از انجام گرادیانت دمایی در PCR بصورت جدول 4 بهینهسازی گردید:
جدول:4 برنامه دمایی- زمانی استفاده شده برای Real Time PCR
بررسی دادههای حاصل از تکثیر قطعات موردنظر ژنها در اثر انجام Real Time PCR انجام شد، پس از به دست آوردن CT رقتهای سریالی cDNA الگوی مورد استفاده در چرخه تکثیر خطآستانه - Treshold - رسم گردید.
نتایج و بحث
نمودار تکثیر - - CT ژن پرولین کربوکسیلات سینتاز - P5CS - و فاز لگاریتمی در شکلهای 1 و 2 نشان داده شده است. فاز لگاریتمی برای هر کدام از نمونهها نشان دهندهی تکثیر مناسب نمونه مورد مطالعه است در این نمودار شروع زودتر فاز لگاریتمی نشان دهندهی تکثیر بیشتر و نهایتا تعداد نسخههای اولیه بیشتر بوده است .
شکل:1 تکثیر cDNA در Real time و خط Threshold برای نشان دادن CT ژن پرولینکربوکسیلاتسینتاز - P5CS -
شکل :2 تکثیر cDNA در Real time و خط Threshold شکل :3 ذوب در PCR برای ژن پرولین کربوکسیلات
برای نشان دادن CT ژن پرولین کربوکسیلات سینتاز - P5CS - سینتاز - P5CS -
هرچقدر CT برای نمونهای زودتر تظاهر داشته باشد نشان دهندهی تعداد بیشتر نسخه اولیه cDNA - شاخص بیان - میباشد.
