بخشی از مقاله
چکیده
پروتئین Strictosidine synthase به عنوان آنزیمی کلیدی در تولید مونوترپنوئیدهای ایندول آلکالوئیدی شناخته میشود، که طی واکنشی با نام Pictete Spengler بین دو ماده tryptamine وsecologanin ، باعث تولید انحصاری 3 - - S - -strictosidine میشود که به عنوان پیشسازی در تولید طیف وسیعی از ترپنوئید ایندول آلکالوئیدهای دارویی ایفای نقش میکند. مونوترپنوئیدهای ایندول آلکالوئیدی کلاسی به خصوص و متنوع از محصولات طبیعی هستند که شامل حدود بیش از 3000 عضو بوده و دارای طیف وسیعی از سازههای شیمیایی است که حجم وسیعی از فعالیتهای بیولوژیکی را پوشش میدهند.
از ویژگیهای دارویی این دسته از مواد میتوان به خواص ضدسرطانی، مالاریا، منظم کننده ضربان قلب اشاره کرد. در مطالعه حاضر توالی کامل cDNA کدکننده آنزیم STR بوسیله روش تکثیر سریع دو انتهای - RACE-PCR - cDNA و بر پایه انتهای mRNA 3' و طراحی آغازگرهای تخصصی بر اساس کتابخانه EST گیاه خشخاش، شناسایی گردید، سپس در بوسیله حامل TA - pTG19-T - در میزبان باکتریایی E-&ROL - +5 - همسانهسازی گردید. همانطور که میدانیم خشخاش یکی از مهمترین گیاهان یکساله علفی در تولید ایندول آلکالوئیدهای ترپنوئیدی است. از مواد موثره این گیاه میتوان به نوسکاپین و پاپاورین اشاره نمود. بخش کدکننده آنزیم STR با عنوان PsSTR در پایگاه GeneBank با کد شناسایی KP143741 ثبت گردیده است. توالی کامل CDS ژن PsSTR شامل 1179 جفت باز که توالی آمینواسیدی با طول 393 را تولید میکند که پروتئین حاصل دارای وزن مولکولی 43/99 کیلودالتون و نقطه ایزوالکتریک 7/52 میباشد.
مقدمه
پروتئین Strictosidine synthase - بانام اختصاری STR و - STR1 یکی از آنزیمهای درگیر در تولید ایندول آلکالوئیدهای مونوترپنوئیدی می باشد که با ترکیب دو بلوک ساختاری اولیه این مسیر نقش خود را ایفا می کند، این دو شامل tryptamine و مونوترپنوئید secologanin و ترکیب حاصل گلوکوترپنوئید Strictosidine است. STR1 به نظر می رسد که به عنوان اولین مرحله متعهد 1 در این مسیر نقش اصلی را در تولید تمام اعضای خانواده مونوترپنوئید ایندول آلکالوئیدها ایفا میکند، نوع واکنشی که توسط STR1 کاتالیز میشود بهعنوان نمونهای استثنایی در بیوسنتز محصولات طبیعی محسوب میشود
این پروتئین متعلق به خانواده لیازها بوده که به صورت خوشهای با کربن و نیتروژن پیوندیافته است. این ماده را میتوان از بسیاری گیاهان که هرکدام از انواع آلکالوئیدها را تولید میکنند استخراج نمود. نام سیستماتیک آن 3-alpha - S - -strictosidine tryptamine-lyase - secologanin-forming - میباشد و از اسامی دیگر آن میتوان به strictosidine synthetase, STR, و 3-alpha - S - -strictosidine tryptamine-lyaseاشاره نمود. نوع واکنشی که توسط STR1 کاتالیز میشود بهعنوان نمونهای استثنایی در بیوسنتز محصولات طبیعی محسوب میشود
این واکنش به عنوان تنها مسیر عملکردی2 میباشد، که در مسیر سنتز آلکالوئیدها قرارگرفته به ویژه در تولید تتراهیدروایزوکوئینولینها که با ترکیب یک آمین با یک آلدئید در شرایط اسیدی حاصل میشود. تنها آنزیمهایی که تا امروز شناخته شده و وابسته به STR1 فعالیت کندمی داَستیل ایزوآیپوکساید سنتاز، داَستیل آیپوکساید سنتاز و نورکوکلایورین سینتاز میباشد. دو آنزیم اول با ترکیب دوپامین بجای تریپتامین با سکولوگانین، واکنش را به سمت تولید آلکالوئیدهای مونوترپنوئیدتتراهیدروایزوکوئینولین هدایت میکند و آنزیم سوم با ترکیب دوپامین.
شروع واکنش های تولیدی آلکالوئیدهای بنزیل ایزوکوئینولین را باعث می شود - مثل مورفین، سنگواینارین یا بربرین - - Samanani et al 2004 - بنابراین STR1 و آنزیمهای ساختاری مربوط به آن بهعنوان آنزیمهای کلیدی در بیوسنتز %50 تمام انواع آلکالوئیدهاست و شناخت بسیار کمی نیز در رابطه با مکانیسم واکنش آن و یا آمینواسیدهای ضروری برای فعالیت آنزیماتیک آنها وجود دارد
واکنشPictet-Spengler
واکنشPictet-Spengler، که سازوکار آن به خوبی شناخته شده و یکی از اجزای اصلی در مسیر بیوسنتز آلکالوئیدها محسوب می شود و نیز به عنوان اولین مرحله در تولید ایندول آلکالوئیدها شناخته می شود. شناخت این آنزیم در سه سطح آنزیماتیک دو تولید آلکالوئیدهای دارای پتانسیل دارویی دسته بندی می شود. اولین دسته شامل طیفی حدود 6000 آلکالوئید بوده و که دارای ساختار ایزوکوئینولینی می باشد - از نمونه های آن می توان به مورفین و کدئین اشاره کرد - . دومین دسته ایندول آلکالوئیدهای مونوترپنوئیدی نامیده می شوند و حدود 2000 عضو دارد و شامل ترکیبات بسیار مهم دارویی مثل مواد ضد سرطانی مثل وین بلاستین و وین کریستین می باشد، دسته سوم که کوچک تر از بقیه است و دربرگیرنده مونوترپنوئیدهای ایزوکوئینئلین می باشد مثل داروهای تهوع آور
STR1 برای اولین بار از سوسپانسیون سلولی Catharanthus roseus و سپس Rauvolfia serpentine به دست آمد و بعدتر در رقمهای دیگر گیاهی از خانواده Apocynaceae وRubiaceae مثل Vinca , Cinchona و Ophiorrhiza شناسایی و تخلیص شد - STR1 . - Ma et al 2006 که از R. serpentine به دست میآید یک پروتئین مونومر با 344 آمینواسید میباشد - Kutchan - 1993، که به ترتیب با انواع تولیدشده در Catharanthus roseus و 79 Ophiorrhiza و 58 درصد عینیت دارد
تکثیر سریع دو انتهای cDNA
تکثیر سریع دو انتهای - RACE - cDNA به طور گستردهای برای مشخص کردن هر دو پایانه cDNA از توالی های ناقص مورداستفاده قرار می گیرد . به طورمعمول محصولات 5' و3'-RACE در نقاطی که با یکدیگر همپوشانی دارند جهت دسترسی به توالی کامل cDNA باهم منطبق می شوند. فرومن و همکاران در سال 1988 متود RACE-PCR را معرفی نمودند که این تکنیک به طور گسترده ای برای به دست آوردن توالی کامل cDNA از قطعات ناقص مورداستفاده قرار می گیرد زیرا RACE هم در ابعاد زمانی و هم هزینه نسبت به روشهای کلونسازی از کتابخانههای پلازمیدی و فاژی کارآمدتر میباشد
از زمانی که واکنش زنجیرهای پلیمراز توسعه یافته است و به طبع آن شرایط واکنش های مربوطه نیز ارتقاءیافته، این تکنیک در بسیاری از جنبههای تحقیقات زیستی جای خود را بازکرده است. روش RACE-PCR با اسامی دیگری مثل Anchored PCR و one sided PCR نیز شناخته میشود، البته روشهای تغییریافتهای نیز بهمرور از آنها حاصل گشته که از این دسته میتوان به LA- - Ligation anchored PCR - PCR، - Single strand ligation to ss cDNA Ends - SLIC-PCR، RNA ligase - RLM-RACE - mediated RACE، - Reverse ligation mediated PCR - RL-PCR اشاره کرد
از مثالهای استفاده از این روش که تاکنون به کارگرفته شده میتوان به شناسایی ژنهای رمز کننده آنزیم سنتز کننده نشاسته گرانوله در درخت سدر مقدس - Gu et al 2013 - ، همسانه سازی قطعات انتهای 3' و 5' ژن تیروزین آمینوترنسفراز برای دستیابی به توالی کامل آن در - Lu et al 2013 - Perilla frectescens و نیز توالی یابی ژن CYP3A در ماهی Scophthalmus - Sun et al 2013 - maximus اشاره کرد.
ماهیت RACE آداپتوری است که بهوسیله یک توالی شناختهشده به یکی از پایانههای cDNA الحاق می شود و سپس منطقه بین آداپتور و توالی شناخته شده به وسیله واکنش زنجیره پلیمراز تکثیر می شود. از زمان انتشار اولین مقاله در سال 1988 در این رابطه RACE به ابزاری عالی جهت کلون سازی ژن های جدید بدل گشت، هم اکنون RACE تبدیل به مؤثرترین روش برای کلون کردن دو انتهای cDNA شده است.
خشخاش ازجمله گیاهانی است که حاوی متابولیک های ثانویه بسیاری می باشد که اکثر آن ها از گروه آلکالوئ یدها هستند. خشخاش بانام علمی Papaver somniferum L. متعلق به خانواده Papaveraceae ، گیاهی است دیپلوئید، علفی و یکساله که بومی غرب آسیا و جنوب شرقی اروپا می باشد . امروزه مشخص شده است که خواص دارویی خشخاش از آلکالوئیدهای موجود در آن ناشی میشود - . - Tetenyi 1997 بررسیهایی که با استفاده از روش فلوسایتومتری انجامشده، نشان داده است که غیر از نوع Setigerum که تتراپلوئید است بقیه انواع خشخاش دیپلوئید و 2n = 2x = 22 میباشند
