بخشی از مقاله
چکیده
تنش سرما از عوامل محدودکنندهي رشد برنج است. الگوهاي بیان ژن تحت تنشهاي زیستی و غیر زیستی تغییر می-کند. پروتئینهاي NAC یک گروه بزرگ از عوامل رونویسی هستند و درکنترل تنش نقش دارند. ژن OsNAC6 از این خانواده به دلیل نقش فعال در رونویسی از میان ژنهاي پاسخ گو به سرما انتخاب شد. الگوي بیان این ژن تحت تیمار سرما در ژنوتیپ حساس - هاشمی - و لاین مقاوم - PR - با استفاده از دستگاه Real time PCR بررسی شد. بیان این ژن در ژنوتیپ حساس در تمام ساعات تنش کمتر از لاین مقاوم بود. پاسخ لاین مقاوم به تنش سریعتر از ژنوتیپ حساس بود.
کلمات کلیدي: برنج، تنش سرما، OsNAC6، qrt PCR
مقدمه
یک عامل مهم محدودکننده در تولید محصول، تنش غیر زنده مانند بیشبود و یا کمبود آب، دماي بالا و پایین و شوري بالا است[2] .بنابراین بهبود مقاومت به تنش غیر زنده ممکن است عملکرد حقیقی را به طور وسیعی در بیشتر گیاهان زراعی افزایش دهد. بیشتر رقمهاي برنج به طور تغییرناپذیري از طریق قرارگیري طولانی مدت در برابر دماهاي سرمازدگی در مرحلهي اولیهي رشد گیاهچهاي آسیب پذیر هستند. تحت تنش غیرزنده بیان بسیاري از ژنها القا می-شود و محصولات این ژنها نقش مهمی را در واکنش به تنش و ایجاد مقاومت بازي میکند.[13]
محصولات ژنهاي القایی با تنش در 2 گروه طبقه بندي میشوند: گروه اول شامل پروتئینهاي عملکردي یا پروتئینهایی هستند که احتمالا در مقاومت به تنش عمل میکنند.از این گروه میتوان به پروتئینهاي LEA، پروتئین-هاي القایی با دهیدراسیون RD - و ERD - ، پروتئینهاي سازگاري به سرما - - COR، پروتئینهاي مربوط به سنتز محافظت کنندههاي اسمزي و غیره اشاره کرد. گروه دوم شامل پروتئینهاي تنظیمی هست که این پروتئینها در تنظیم انتقال پیام و بیان ژن نقش دارند و احتمالا در پاسخ به تنش عمل میکنند.
این پروتئینها انواع مختلفی از عوامل رونویسی مانند RING finger، zinc finger، MYB و NAC و عوامل رونویسی خانوادهي ; bzip پروتئین کینازها، پروتئین فسفاتازها و آنزیمهاي درگیر در متابولیسم فسفولیپید هستند.[12]ژنهاي مسئول پاسخ به تنشهاي مختلف میتوانند به ژنهاي دیرالقا شونده و زودالقا شونده تقسیم شوند. ژنهاي زودالقا شونده در دقیقههاي اول ادراك پیام تنش القا میشوند و بیان آنها اغلب سریع و موقتی است. عوامل رونویسی مختلف در لیست ژنهاي زود القا قرار میگیرند.[8]
فرآیند پاسخ به سرما پیچیده است و شامل ژنهاي زیادي است که در یک شبکه پیچیده با هم تعامل میکنند. [6] از 2604 ژن داراي افزایش تنظیم در سرمازدگی حدود 6 درصد - 148 - عامل رونویسی هستند که بر اساس طبقه بندي اطلاعات عوامل رونویسی برنج شناسایی شدهاند اکثریت عوامل رونویسی داراي افزایش بیان در سرمازدگی در مرحلهي 6 - 1 ساعت اول - و مرحلهي 6 - 2 تا 24 ساعت - فعال شدند، که ثابت میکند تغییرات حیاتی رونویسی در 24 ساعت اول اتفاق می افتد. [4,14,16]
ژن هاي خانوادهي NAC ویژهي گیاه هستند.[9] این ژنها داراي یک دومین بسیار حفاظت شده در منطقهي -N ترمینان هستند. این منطقه توسط [1] Aida دومین پروتئین NAC نامیده شد. ژنهاي زیر خانوادهي ATAF از خانوادهي NAC شامل ژنهاي پاسخ به تنش هستند. ژن OsNAC6 در برنج یک عضو از زیر خانوادهي ATAF هست. برنج 75 ژن NAC دارد.[10] بیان ژن OsNAC6 توسط ABA و تنش هاي غیرزنده - شامل سرما، شوري بالا و خشکی - ، جاسمونیک اسید، جراحت و بیماري بلاست القا شد[11] به دلیل اهمیت این ژن در فعال سازي دیگر ژن-هاي مسئول تنش، الگوي بیان آن در این پژوهش با استفاده از روش Real time PCR مورد مطالعه قرار گرفت.
روش کار
در این پژوهش از لاین PR27137-CR153 و ژنوتیپ هاشمی که طبق گزارش مؤسسه تحقیقات برنج کشور واقع در رشت به ترتیب اولی مقاوم به سرما و دومی حساس به سرما می باشد، استفاده شد. بذور این دو ژنوتیپ ابتدا به وسیلهي هیپوکلریت سدیم 30 درصد ضدعفونی شدند و پس از 3 بار شست و شو با آب مقطر استریل به منظور جوانه زنی بر روي کاغذ صافی درون پلیت در دماي 28 درجه قرار گرفتند. پس از گذشت 7 روز گیاهچهها به محلول غذایی یوشیدا[15] منتقل شدند و و در اتاقک رشد با دماي 25 درجه سانتی گراد قرار گرفتند.
گیاهچه ها پس از گذشت دو هفته از رشدشان براي اعمال تنش سرما - دماي 5 درجه سانتی گراد - به انکوباتور با سیکل نوري 15 ساعت روشنایی و 9 ساعت تاریکی انتقال یافتند. نمونه گیري از گیاهچه ها قبل از اعمال تنش و در زمانهاي 3، 6، 12و 24 ساعت پس از اعمال تنش با احتساب 3 تکرار انجام گرفت. نمونه ها بلافاصله در ازت مایع فریز شده و سپس در فریزر -70 درجه قرار گرفتند. استخراج RNA با استفاده از بافر استخراج RNX-plus - شرکت سیناژن - و طبق دستورالعمل این شرکت انجام گرفت.
کمیت RNA هاي استخراج شده با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر و کیفیت آنها از طریق الکتروفورز ژل آگارز 1 درصد مورد بررسی قرار گرفت. ساخت cDNA با استفاده از کیت سنتز cDNA ساخت شرکت فرمنتاز و طبق دستورالعمل این شرکت انجام گرفت. جهت اطمینان از ساخته شدن صحیح cDNA، تکثیر آن براي همهي نمونهها با استفاده از پرایمرهاي اختصاصی ژن مرجع18s rRNA با استفاده از دستگاه PCR انجام گرفت. محصول حاصل از تکثیر این ژن قطعهاي به طول بود که باند مربوط به آن براي همهي نمونه ها بر روي ژل آگارز 1/5 درصد مشاهده شد.
جهت بررسی کمی الگوي بیان ژن OsNAC6 از دستگاه Real time PCR استفاده شد. براي انجام واکنش زنجیرهاي پلیمراز در زمان واقعی - Real time PCR - از کیت Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix ساخت شرکت فرمنتاز استفاده شد. به این منظور 0/8 µl از cDNA به همراه 6/25 µl مسترمیکس qPCR ،0/5 µl از هر آغازگر اختصاصی 10 mM و 3/3 µl آب عاري از نوکلئاز به حجم نهایی 12.5 µl رسانده شد.
جهت نرمال سازي بیان نمونه ها از ژن مرجع 18srRNA به عنوان کنترل داخلی استفاده شد.برنامه حرارتی Real time PCR به صورت واسرشته سازي اولیه به مدت 10 دقیقه در 94، واسرشته سازي ثانویه به مدت 30 ثانیه در 94، اتصال پرایمر به مدت 30 ثانیه در 60، بسط به مدت 45 ثانیه در 72 انجام گرفت. وجود نمودار تک پیکی نشان دهندهي تکثیر اختصاصی ژن OsNAC6 در نمونه هاي مورد بررسی بود. لازم به ذکر است که واکنش Real time PCR با احتساب 3 تکرار براي هر نمونه به منظور کاهش خطاي آزمایش انجام گرفت.
به منظور تعیین میزان بیان نسبی در هر ساعت تیمار سرما نسبت به حالت شاهد - نمونه تیمار نشده - از معادلهي 2 -ΔΔCt استفاده شد..[7]براي نرمال سازي نمونه هاي هدف و نمونه شاهد از کنترل داخلی - ژن مرجع - استفاده شد و مقدار Ct ژن مرجع از مقدار Ct نمونهي مورد نظر کسر شد.
