مقاله تاثیر تیمار خارجی هورمون های آبسیزیک اسید و سیتوکینین بر تحمل تنش اکسیداتیو در دو رقم گندم حساس و مقاوم به تنش طی تنش کم‌آبی

بخشی از مقاله

چکیده

تنظیمکنندههای رشد نقشهای مهمی در تحمل گیاهان به انواع تنشها بازی می کنند. در طرح انجام شده تاثیر هورمونهای سیتوکینین - CK - و آبسیزیکاسید - ABA - و برهمکنش آنها بر مقدار رادیکالهای سوپراکسید و پراکسید هیدروژن در رابطه با اندازهگیری شاخصهای آنتیاکسیدانی جاروب - مهارکنندگی- - scavenging پراکسید هیدروژن و رادیکال سوپراکسید و هیدروکسیل در برگ پرچم دو رقم گندم نان حساس و مقاوم به تنش خشکی طی بروز تنش کمآبی اندازهگیری شد. در این بررسی، برهمکنش دو هورمون سیتوکینین و آبسیزیک اسید موثرترین تیمار هورمونی در بهبود توان آنتیاکسیدانی و کاهش خسارتهای تنش اکسیداتیو طی بروز خشکی بویژه در رقم مقاوم بود.

1. مقدمه و هدف

تمام تنشهای زیستی و غیرزیستی نظیر تنش خشکی سبب بروز تنشهای اکسیداتیو در گیاه میشوند که آثار این تنشها در مرحله زایشی گیاهان بسیار زیانبار میباشد. عقیده بر این است که تنش اکسیداتیو خود به عنوان یک تنش ثانویه مدنظر است. ایجاد تنش های اکسیداتیو با تولید گونه های فعال اکسیژن و نیتروژن ROS - یا AOS و - NOS همراه است . تولید گونه های فعال اکسیژن سبب تهییج دستگاه آنتی اکسیدانی آنزیمی و غیر آنزیمی، بویژه عوامل موجود در چرخه آسکوربات-گلوتاتیون می گردد که می توان میزان برهمکنش این آنتی اکسیدان های آنزیمی و غیر آنزیمی را در قالب شاخص های آنتی اکسیدانی نظیر شاخص جاروب پراکسید هیدروژن، شاخص جاروب رادیکال نیتریک اکسید - NO - ، شاخص توان احیایی آهن - FRAP - ، شاخص جاروب رادیکال DPPH و نظایر این تستها اندازهگیری کرد 

تنظیمکنندههای رشد گیاهی مانند آبسیزیکاسید از بازوهای مهم گیاهان برای مقابله با تنشهای زیستی و غیر زیستی نظیر تنش خشکی هستند. با اینحال افزایش آبسیزیکاسید در گیاهان سبب نزول برخی هورمونها مانند سیتوکینین می شود، با توجه به اینکه این دو هورمون در شرایط طبیعی و بروز تنش تاثیرات متضادی با یکدیگر دارند. البته کاهش سطح درونی هورمون سیتوکینین می تواند در مسیرهای وابسته یا غیر وابسته به آبسیزیک اسید ایجاد گردد.

در مورد تاثیر سیتوکینین بر میزان تنش اکسیداتیو قدرت آنتی اکسیدانی با توجه به تنوع این هورمون نتایج ضد و نقیضی در دست می باشد. با اینحال آنچه در مورد آبسیزیک اسید اثبات گردیده است این است که از یک سو سبب افزایش گونه های فعال اکسیژن مانند پراکسید هیدروژن میشود که مهمترین دلیل آن را به مانند سیتوکینین میتوان به رونق بخشیدن واکنشهای دفاعی ترارسانی علامت - signal transduction - نسبت داد. البته افزایش زیاد هورمون آبسیزیکاسید باعث افزیش بیان سیستمهای آنزیمی و غیرآنزیمی آنتیاکسیدانی و سرکوب گونه های فعال اکسیژن می شود

.2  تئوری و پیشینه تحقیق

همبستگی متقابلی بین افزایش درونی و کاربرد خارجی برخی از انواع سیتوکینین ها مانند بنزیل آدنین و بنزیل آمینو پورین با کاهش رادیکال های فعال اکسیژنی و نیتراتی مشاهده شده است .[11] در یک حالت بالعکس، در گیاهان مدل تنباکو و آرابیدوپسیس مشاهده شده است که افزایش درونی هورمون سیتوکینین باعث کاهش فعالیت دو آنزیم آسکوربات پراکسیداز و کاتالاز و سطوح گلوتاتیون گردید. به طور کلی افزایش سیتوکینین در این گیاهان مدل باعث افزایش سطح گونه های فعال اکسیژن و به راهاندازی مسیرهای ترارسانی علامت شده بود

در گیاه گندم، کاربرد هورمون به صورت پاشیدن - spray - روی برگ ها، در حالی که گیاه در معرض کمبود نیتروژن قرار گرفته است باعث کاهش رادیکال های آزاد و کاهش زیان های ناشی از پراکسیداسیون لیپیدها شده است

همچنین بررسی ها نشان داده است که ABA می تواند فعالیت و بیان ژن ها ی آنزیم های آنتی اکسیدان به خصوص آنزیم های سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز را تشدید کند

در بررسی انجام شده دیگری، ثابت شده است که کاربرد توام ABA و CK می تواند پیری برگ ناشی از ایجاد تنش خشکی را به تعویق اندازد که در مورد هر دو هورمون و با تاکید بیشتر در مورد سیتوکینین صادق است. تاثیر این دو هورمون و به خصوص سیتوکینین به تعویق افتادن زرد شدن برگ - تجزیه کلروفیل و تاثیر بر روی آنزیم کلروفیلاز - و تغییرات ویژه در سلول - تجزیه پروتئین ، پراکسیداسیون لیپید - و بیان برخی ژنها اثبات شده است 

.3  مواد و روشها

.1-3 محل تحقیق ، شرایط رشد گیاه و طراحی تیمارهای آزمایش

این پژوهش به صورت یک طرح فاکتوریل و در قالب طرح بلوک های کاملا تصادفی با 3 تکرار در 2 سطح آبیاری کامل و خشکی و 4 سطح تیمار هورمونی - بدون هورمون - شاهد - ، سیتوکینین، آبسیزیک اسید و برهمکنش سیتوکینین و  آبسیزیکاسید - در هر کدام از سطوح آبیاری کامل و قطع آبیاری - خشکی - انجام گرفت. پژوهش مد نظر بر روی 2 رقم حساس - MV-17 - و مقاوم - پیشگام - گندم در شرایط مزرعه انجام گرفت.

کلیه مراحل آزمایش در موسسه بیوتکنولویی و  کشاورزی کرج و دانشگاه خوارزمی و دانشگاه یزد انجام شدند. آبیاری تیمار شاهد به صورت معمول تا پایان دوره رشد دو رقم  یاد شده انجام شد در حالیکه آبیاری تیمار تنش خشکی کرتها در مرحله آغاز به سنبله نشستن یا آبستنی قطرع گردید. کل منطقه زیر کشت طبق شکل زیر بوسیله شیلتر پوشانیده شد - شکل . - 1 بعد از حذف اثرات حاشیهای، در زمانهای مختلف شامل شروع گرده افشانی - زمان صفر - ، 7 ، 14 و 28 روز ، 60 بوته به طور تصادفی انتخاب و برداشت گردیدند. برگ های پرچم از نمونه ها جدا گردیدند و بالافاصله به -20 درجه سانتیگراد منتقل گردیدند.

کلیه آنالیزهای مربوط به سنجش محتوای رادیکال سوپراکسید، رادیکال هیدروکسیل، پراکسید هیدروژن و نیز سنجش شاخص های جاروب پراکسید هیدروژن و توان احیایی آهن - FRAP - بر روی برگ پرچم انجام گردید. با توجه به اینکه برداشت های چهارم و پنجم کاملترین برداشت ها از لحاظ تیمار هورمونی بودند و برداشت چهارم معنی دارترین نتایج را نشان داد، نتایج بر اساس برداشت چهارم ارائه شدند.

شکل.1 الف - نصب ستون و شیلتر ها بر روی کرت های دو رقم گندم کشت شده در مزرعه پژوهشگاه بیوتکنولوژی و کشاورزی ایران - کرج - . ب - استفاده از برگ پرچم به عنوان منبع بررسی تغییرات پارامترهای تنش اکسیداتیو و قدرت آنتی اکسیدانی.

.2-3 اندازه گیری میزان رادیکال سوپراکسید - O2- -

یک گرم نمونه برگ پرچم فریز درای شده - freeze dried sample - به طور یکنواخت کوبیده و مقدار 3 میلی لیتر بافر فسفات پتاسیم 65 میلی مولار - pH 7.8 - آن افزوده شد. مخلوط حاصل به مدت 10 دقیقه با دور 5000 rpm سانتریفیوژ Beckman Coulter - مدل - Allegra - 64R گردید. محلول رویی جهت سنجش و انجام مراحل بعدی استخراج شد.

یک میلی لیتر از محلول فوق را برداشته و به همرا ه 0/9 میلی لیتر بافر فسفات پتاسیم 65 میلی مولار و 1 میلی لیتر هیدرو کلراید هیدروکسیل آمین 10 میلی مولار مخلوط شد و در دمای 25 درجه سانتی گراد به مدت 20 دقیقه قرار گرفت. پس از آن مقدار معادل حجم محلول اتیل اتر اضافه شد و با دور 1500 rpm به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ گردید. میزان جذب در طول موج 530 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد.

با استفاده از منحنی نرمال استاندارد، مقدار یون سوپر اکسید بر حسب واحدنانومتر بر دقیقه بر واحد وزن خشک تنظیم گردید. برای رسم منحنی استاندارد از رقت های 0، 5، 10، 25، 50، 75 و 100 میکرومول در لیتر گزانتین با اضافه شدن 1 میلی لیتر هیدروکسیل آمین 10 میلی مولار و یک واحد آنزیمی گزانتین اکسیداز به هر یک از رقت های ذکر شده، استفاده شد .

.3-3 اندازه گیری میزان پراکسید هیدروژن - H2O2 -

کلیه مراحل در محیط نیمه تاریک و در اتاق سرد انجام گرفت. مقدار 0/35 گرم نمونه را با نیتروژن مایع در هاون خرد نموده تا به صورت پودر درآمد و به تیوب 15 میلیلیتر منتقل شد تا مقدار 5 میلیلیتر محلول اسید تریکلرواستیک %0/1 که در حمام یخ قرار داشت به نمونهها اضافه شد. تیوب حاوی نمونه هموژنیزه شده در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه با سرعت 12000 rpm سانتریفیوژ گردید. 0/5 میلیلیتر از محلول روشناور را به یک تیوب جدید مستقر در حمام آب یخ که حاوی 0/5 میلیلیتر بافر فسفات 10 میلیمولار و 1 میلیلیتر محلول یک مولار یدید پتاسیم بود، اضافه شد.