بخشی از مقاله
هدف: ویتامین ب12 در فرآیندهاي متابولیکی بافتهاي انسان داراي نقشهاي فیزیولوژیکی مهمی است. تولید ویتامین ب12 به صورت شیمیایی بسیار دشوار و پرهزینه است. لذا پژوهشگران رو به سوي تولید میکروبی آوردهاند. استفاده از ضایعات کارخانجات، تولید این ویتامین را مقرون به صرفهتر خواهد بود. در این بررسی تلاش بر این است که این ویتامین را در محیطی حاوي ملاس و با خوراكدهی با لاکتوز تولید نمود.
مواد و روشها: تخمیر با استفاده از سوبستراي پایه ملاس و با کشت همزمان باکتري پروپیونیباکتریوم فرئودنریچیئی زیرگونه شرمانی و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس انجام شد. pH فرمنتور با استفاده از سود 1 نرمال معادل 6/5 نگاهداشته شد دماي آن نیز روي 30°c تنشیم شد. پس از گذشت 36 ساعت از شروع کار سیستم با لاکتوز خوراكدهی شد. میزان ویتامین ب 12 و توده سلولی تولیدي به ترتیب با روشهاي کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا و خشککن انجمادي اندازهگیري شدند.
نتایج و بحث: غلظت نهایی ویتامین ب12 تولید شده در این بررسی معادل 34/67 -1/527 mg/L و غلظت نهایی توده سلولی نیز معادل± 0/07 g/L 1/786 بود. نتایج این بررسی نشان داد که در صورت استفاده از ملاس میتوان به بازدهی بالایی از تولید ویتامین ب 12 دست پیدا کرد.
نتیجهگیري کلی: استفاده از پسماندهاي ضایعات کارخانجات مختلف میتواند براي تولید ترکیبات با ارزش غذایی مورد استفاده قرار گیرند.
مقدمه: ویتامین ب12 یک ترکیب اساسی در فرآیندهاي بافتی با کاربردهاي فیزیولوژي متعدد است و به طور وسیع در صنایع غذایی و داروسازي کاربرد دارد . - 1 - ویتامین ب12 محلول در آب و قرمز رنگ است که رنگ آن به دلیل وجود کمپلکس کبالت-حلقه کورینی است . - 2 - همچنین، یک ترکیب زیستی مهم و فعال به عنوان عامل خونساز در پستانداران است. ویتامین ب12 به شکلگیري و بازسازي سلولهاي قرمز خون و در نتیجه جلوگیري از کمخونی کمک می- کند.
این ترکیب به عنوان یک مکمل غذایی براي حیوانات و انسان نیز به شمار میرود. ویتامین ب12 اولین بار در سال 1948 از جگر استخراج و به منظور درمان کمخونی استفاده شد . - 3 - از آنجایی که سنتز شیمیایی ویتامین ب12 بیش از 70 مرحله دارد، از لحاظ تکنیکی، تولید صنعتی با استفاده از روشهاي شیمیایی و مراحل تصفیه پس از آن بسیار دشوار، گران، ناامن براي اپراتور و ناسازگار با محیط زیست است.
- 3 - از سوي دیگر در ساختار ویتامین ب12 حلقهي کورینی است که توسط باکتريها ساخته میشود - 2 - و لذا ویتامین ب12 با استفاده از فرآیند تخمیر میکروبی تولید شده است . - 3 - از جمله باکتريهاي تولیدکننده ویتامین ب12 میتوان به آئروباکتر، سیتروباکتر ، آگروباکتر، آلکالیجنس، آزوتوباکتر، اکتینومایسس، باسیلوس، کلستریدیوم ، کلبسیلا، کورینهباکتر، فلاووباکتر، میکرومونوسپورا، مایکوباکتر، نوکاردیا، پروپیونیباکتر، لاکتوباسیلوس، سودوموناس، ریزوبیوم، سالمونلا، سراتیا، استرپتومایسس، استرپتوکوکوس اشاره کرد . - 4 - در این میان، سودوموناس و پروپیونیباکتر براي تولید صنعتی به کار میروند 7 - و . - 8 از بین دو باکتري نامبرده در صنعت غذا، پروپیونیباکتر به خصوص گونه پروپیونیباکتریوم فرئودنریچیئی بر سودوموناس ارجحیت دارد زیرا تولید اندوتوکسین و اگزوتوکسین نمیکند و لذا این باکتري مورد تأیید سازمان غذا و دارو میباشد . - 9 ,3 -
به کارگیري روشهاي مختلف مهندسی متابولیک در علم بیوتکنولوژي امکان افزایش تولید ویتامین ب12 را ممکن میسازد. همچنین تغییر ترکیب محیط کشت و یا به عبارت دیگر بهینهسازي محیط کشت به منظور تولید مقدار بیشتر ویتامین ب12 صورت میگیرد. به عنوان مثال در سال 1993، کواسادا و همکارانش محیط کشت پروپونیباکتریوم اسیديپروپیونیسی را براي یک سامانه پیوسته و با مصرف ساکارز به عنوان منبع کربنی بهینهسازي نمودند.
آنها همچنین، متغیرهاي مختلف عملیاتی اعم از pH، دما، غلظت سوبسترا، عوامل رشد، عصاره مخمر، بتائین، 5 و 6 ديمتیل بنزیمیدازول را نیز مورد بررسی قرار دادند . - 10 - روش دیگر، مهندسی ژنتیک است که در این روش یا با ایجاد جهش و تبدیل ژنومی که تولید ویتامین ب12 را بیشتر تولید میکند و یا از طریق وارد نمودن ژنی که ویتامین ب12 را تولید میکند به ژنوم باکتري، منجر به افزایش میزان ویتامین ب12 تولیدي میگردد. در این زمینه نیز محققان بسیاري از جمله یانگاسمیت و همکاران او از تثبیت سلولها براي تولید مقدار بیشتري ویتامین ب12 استفاده نمودند . - 5 -
از آنجایی که مهمترین مشکلی که استفاده از پروپیونیباکترها براي تولید ویتامین ب12 دارد، تجمع متابولیتهاي ممانعتکننده از جمله اسید پروپیونیک و اسید استیک میباشد. در سال 2000، میانو و همکارانش براي حل این مشکل روشهاي متعددي را بررسی کردند که از میان آنها بازیافت سلولی را به عنوان بهترین روش پیشنهاد نمودند . - 11 - همچنین در سال 2011 نیز تجهیزات استخراج در جاي محصول که شامل سیستم جذب بستر گسترده شده1 و راکتور تخمیر است، طراحی شد و به منظور حذف ممانعتکنندگی اسید پروپیونیک در تولید همزمان اسید پروپیونیک و ویتامین ب12 در سامانه ناپیوسته خوراك- دهیشده تکمرحلهاي به کار گرفته شد . - 1 -
تاکنون بررسیهاي متعددي در زمینه تولید ویتامین ب12 با استفاده از منابع کربنی مختلفی اعم از ملاس - 12 - ، سوکروز - 10 ,12 - ، آبپنیر، گلیسرول - 8 - ، ضایعات لبنی - 13 - تولید شده است و همچنین مطالعاتی نیز بر روي تولید این ترکیب در سامانه پیوسته - 5 - ، ناپیوسته 26 - ، - 11 و خوراكدهی شده - 1 - انجام شده است. مشکلات سامانه پیوسته و ناپیوسته به ترتیب احتمال بالاي موتاسیون و محدودکنندگی سوبسترا بوده که این معایب را با سامانه خوراك دهیشده میتوان رفع نمود.
کرال و همکاران او در سال 2008، در تخمیر غوطهوري، 8 گونه پروپیونیباکتر را با استفاده از منابع کربنی ملاس نیشکر، گلیسرول و لاکتات و با هدف تولید اسید پروپیونیک تخمیر نمودند و اذعان داشتند که استفاده از ملاس، تولید توده سلولی بالایی را به همراه دارد که مقدار بالاي توده سلولی میتواند منجر به تولید مقادیر بالاي ویتامین ب12 شود . - 14 - تاکنون هیچ مطالعهاي در زمینه تولید ویتامین ب12 در سامانه ناپیوسته خوراكدهیشده با لاکتوز در محیط کشت پایه ملاس توسط پروپیونیباکتریوم فرئودنریچیئی صورت نپذیرفته است. همچنین با توجه به پیشبینی افزایش مقدار ویتامین ب12 تولیدي در صورت حضور ملاس در محیط کشت، در این پژوهش، تولید همزمان اسید پروپیونیک و ویتامین ب12 در سامانه ناپیوسته خوراكدهیشده با لاکتوز در محیط کشت پایه حاوي ملاس بررسی شد.
مواد وروشها
محیط کشت و باکتريها:
پروپیونیباکتریوم فرئودنریچیئی زیرگونه شرمانییی - PTCC1661 - به صورت لیوفیلیزه از DSMZ خریداري و در محیط مایع پروپیونیباکتریوم کشت و هر ماه پاساژ داده شد. این محیط کشت شامل %1 کازئین، %0/5 عصاره مخمر و %1لاکتات سدیم در1000ml آب بود که پس از تهیه و تنظیم pH در دامنه 7-7/2 در دماي 121°C به مدت 15 دقیقه اتوکلاو شد. به منظور تعیین تعداد دقیق باکتري موجود، رقتهاي 10-6 تا 10-12 روي محیط کشت سدیم لاکتات آگار کشت داده شد.
محتویات محیط کشت عبارتند از : - g/l - کازئین10، عصاره مخمر 10، لاکتات سدیم 10، گلیسین 2، کلرید سدیم 1/5، تواین هشتاد 0/5، ديپتاسیم هیدروژن فسفات 0/25، آگار .12 پس از تنظیم pH در دامنه 7 0/2 محیط کشت تهیه شده در دماي 121°C به مدت 15 دقیقه اتوکلاو شد. پلیتهاي کشت داده شده به مدت 7 روز در دامی 30°C در شرایط بیهوازي قرار داده شدند . - 36 - بر اساس نتایج به دست آمده، سوسپاسیون موجود در هر ویال تهیه شده حاوي 6 1010cfu/ml پروپیونیباکتریوم فرئودنریچییی زیرگونه شرمانیئی بود. لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس - PTCC 1643 - از سازمان پژوهشهاي علمی و صنعتی ایران تهیه شد. این باکتري نیز هر ماه در محیط کشت لاکتوباسیلوس براث پاساژ داده شد. شرایط رشد این باکتري دماي 30œC و بیهوازي بودن محیط است. محیط کشت پایه فرمنتور متشکل از 1000ml محیط پیشکشت حاوي عصاره مخمر با غلظت 10 g/l، به عنوان منبع تأمین کننده نیتروژن و 200ml ملاس با غلظت 125 g/l منبع کربنی بودند.
آمادهسازي مایه تلقیح:
ابتدا یک محیط کشت جامد نگهداري حاوي مواد زیر تهیه گردید - مقادیر بر حسب : - g/l پتاسیم ديهیدروژن فسفات 1، ديآمونیوم هیدروژن فسفات 2، میلیگرم سولفات آهن 7 آبه 5، سولفات منیزیم 7 آبه 10، سولفات منگنز آبدار 0/0025، کلرید کلسیم 6 آبه 0/01، کلریدکبالت 6 آبه 0/01، عصاره مخمر5، لاکتات سدیم 5 و آگار. pH را پیش از اتوکلاو روي 6/8 تنظیم شد. از باکتري موجود در محیط کشت مایع پروپیونیباکتر روي آن کشت داده و به مدت 48 ساعت در30c̊ و تحت شرایط بیهوازي انکوبه شد. پس از گذشت 48 ساعت، یک کلنی از روي این محیط کشت برداشته به 2ml از محیط پیشکشت افزوده شد و مجدداً به مدت 48 ساعت در انکوباتور30°C قرار داده شد.
محیط پیشکشت و مایه تلقیح ترکیبات مشابهی با محیط نگهداري دارند با این تفاوت که محیط پیشکشت و مایه تلقیح آگار ندارند، به علاوه اینکه سدیم لاکتات در این محیطها به 20 g/l و عصاره مخمر نیز به 10 g/l افزایش یافتند. بعد از گذشت 48 ساعت، 0/4 ml از آن به 40 ml از محیط پیشکشت افزوده شد و این بار نیز 48 ساعت در انکوباتور 30œC گذاشته شد. مایه تلقیح حاصل حاوي2/36 109 cfu/ml باکتري میباشد.به منظور آمادهسازي مایه تلقیح ترکیبی از دو محیط کشت را با نسبت 1 به 4 از لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس به پروپیونیباکتریوم فرئودنریچیئی تهیه گردید.
تخمیر ناپیوسته خوراكدهیشده:
مایه تلقیحی با نسبت %1 از لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و پروپیونیباکتریوم فرئودنریچیئی به محیط کشت پایه موجود در فرمنتور تلقیح و سیستم با دماي ثابت 30œC و pH=6/5 شروع به کار نمود. پس از گذشت 35 ساعت خوراكدهی پیوسته با لاکتوز با سرعت ثابت 0/04l/h آغاز شد. به منظور اندازهگیري میزان ویتامین ب12 تولید شده، پس از 96 ساعت، نمونهبرداري انجام شد.
اندازهگیري بیومس:
به طور مرتب، هر 12 ساعت یکبار نمونهبرداري از فرمنتور تحت شرایط استریل صورت پذیرفت. نمونهها به مدت 10 دقیقه در دماي 30œC، با سرعت 12000 دور در دقیقه سانتریفوژ شدند. رسوب حاصل را خشک نموده و میزان بیومس را در طی مدت تخمیر به دست آمد.
اندازهگیري ویتامین ب:12
با توجه به اینکه تولید ویتامین ب12 داخل سلولی میباشد، به منظور اندازهگیري آن میبایست مراحل آمادهسازي آن انجام پذیرد. بدین منظور نمونه استخراجی را به مدت 10 دقیقه، در دماي 4œC و 12000 دور بر دقیقه سانتریفوژ نموده و رسوب حاصل را به مدت 15 دقیقه در بافر فسفات 0/1M حاوي %0/01 سیانید پتاسیم در pH=6 جوشانده شد. محلول حاصل را به وسیله فیلترسرنگ 0/45 µm فیلتر نموده و میزان ویتامین ب12 آن با استفاده از روش HPLC اندازهگیري شد. سیستم با ستون آلژینات مجهز شده بود و دما هم 40œC قرار داده شد. ترکیبی از فسفاتديهیدروژنسدیم 0/25 M با pH=3/5 و متانول با نسبت 75 به 25 با سرعت 1 ml/min به عنوان فاز متحرك بود. حجم تزریق معادل 16 µl بود. طول موج روي 362 nm تنظیم شد.
نتایج و بحث:
روند تغییرات توده خشک سلولی در طی دوره تخمیر: روند تغییرات توده خشک سلولی در طی دوره تخمیر در شکل 2 نشان داده شده است. همان- طور که در شکل مشخص است، در طی 35 ساعت اولیه ملاس تنها تأمینکننده کربنی است. در 24 ساعت اولیه شیب نمودار کم و پس از آن تا 36 ساعت کمی افزایش تغییرات توده خشک سلولی مشاهده میشود. پس از گذشت 36ساعت از شروع تخمیر، تقریباً همزمان با شروع خوراكدهی، شیب نمودار به شدت افزایش مییابد و رشد سریع باکتري تا رسیدن به بیشترین مقدار آن - 75/05mg/l -٦٠/١٧٨٦ - در 60 ساعت ادامه مییابد.
پس از آن تغییرات محسوسی در توده خشک سلولی مشاهده نشد. روند تغییرات ویتامین ب12 در طی دوره تخمیر: روند تغییرات ویتامین ب12 در شکل 2 نشان داده شده است. مشاهدات نشان داد که تولید ویتامین ب12 در این بررسی از 60 ساعت با شیبی قابل توجه شروع و به مرور زمان تا پایان تخمیر نیز این تغییرات بیشتر میشود و شیب نمودار مرتباً افزایش می- یابد تا در نهایت به غلظت نهایی 34/66 -1/52 mg/l میرسد.
