بخشی از مقاله
چکیده:
در این تحقیق برای بهینه سازی تولید لیپوزومها به روش گرمایی، از روش سطح پاسخ استفاده شد. در این روش طرح مرکب مرکزی با سه متغییر مستقل به نامهای غلظت فسفولیپید - 2 -30mʽ - ، سرعت فرآیند - 500 -1360 rpm - و زمان فرآیند - 30 -90min - استفاده و اثرات این متغییرها روی اندازه ذرات لیپوزوم ها ارزیابی شد. مقادیر بهینه متغییرهای غلظت فسفولیپید، سرعت فرآیند و دمای فرآیند در بهینه سازی، به ترتیب 30 - P - ، 930 - rpm - و 90 - min - با سایز ذرات در محدوده 150- 180 نانومتر و مقدار پروتئین موجود در سیستم نانولیپوزوم بر اساس فرمول محاسبه شد. نتایج حاصل از میزان محصورسازی کپسولهای حاوی نایسین، در حدود 10 تا % 30 محاسبه گردید.
واژههای کلیدی: باکتریوسین، انکپسولاسیون، نانولیپوزوم، روش سطح پاسخ، بهینه سازی
مقدمه در اوایل سال 1960 آلک بنگام از کشور انگلستان اعلام کرد که فسفولیپیدها در آب به صورت وزیکولهای چند جداره هستند که هر جداره متشکل از غشای دو لایه ای لیپیدی است. این ساختار در سال 1967 بانگوزوم نام گرفت و در سال 1968 توسط سسا و ویزمن لیپوزوم - ترکیبی از دو واژه یونانی لیپو و سوما به معنای چربی و ساختار - نام گرفت - خسروی دارانی و محمدرضا مظفری، . - 1390 نانولیپوزوم ها ذرات ریزی هستند که از یک یا چند لایه فسفولیپید، دو لایه تشکیل شده اند. خصوصیات منحصر به فرد این ذرات سبب شده است که کاربردهای متعددی در زمینه های علوم و فنآوری داشته باشند.
نانولیپوزوم ها می توانند منجر به رهایش کنترل شده، عوامل مختلف زیست فعال از جمله ترکیبات غذایی و فراسودمند در مکان و زمان مناسب شوند. از این رو آنها اثرگذاری و جذب سلولی مواد ریز پوشانی شده را افزایش می دهند Mozafari - و همکاران، - 2005 ترکیبات واکنشگر، حساس یا فرار و همچنین باکتریوسین ها را می توان با استفاده از نانولیپوزوم ها به ترکیبات پایدار تبدیل کرد. شناخته ترین باکتریوسین، نایسین است که به طور گسترده همراه با مواد غذایی استفاده می شود. نایسین، پلی پپتیدی با 34 اسید آمینه و وزن مولکولی 3510 دالتون است که توسط لاکتوکوکوس لاکتیس تولید می شود. این ترکیب در دمای کمتراز 25 c و در بسته بندی دور از نور مستقیم پایداری خوبی دارد.
همچنین استفاده از این ترکیب به عنوان ماده ضد میکروبی بدون اثر نامطلوب روی طعم مواد غذایی بر روی باکتری های گرم مثبت و اسپورهای آنها موثر است. اما استفاده از نایسین در فرم آزاد گران بوده و افزودن آن به صورت مستقیم به مواد غذایی باعث ایجاد مشکلاتی عدیده ای از جمله تجزیه پروتئولیتیک و واکنش پپتید های ضد میکروبی با ترکیبات غذایی مثل چربی و پروتئین شده و از این رو باعث کاهش فعالیت ضدمیکروبی این ترکیب می شود Mozafari - و همکاران، . - 2008 در تحقیقی که بر روی اثر نایسین آزاد و انکپسوله شده را در پنیر انجام شد، نتایج نشان داد که استفاده از نایسین انکپسوله شده تاثیری بر روی پروتئولیز و خصوصیات رئولوژی پنیر نداشته در حالی که استفاده نایسین به صورت آزاد موجب افزایش پروتئولیز در این محصول شده ولی تاثیر زیادی بر روی خصوصیات رئولوژی پنیر نداشت Benech - و همکاران، . - 2002 در بررسی که بر روی نمونه های لیپوزومی حاوی نایسین - حاوی آسپاراژین -
و نمونه های آزاد - لیپوزوم نشده - بر روی پنیر در غلظت نهایی 300 IU/g اضافه شد، نشان داد که در طی 6 ماه دوره رسیدگی پنیر، جمعیت لیستریا 1/5-3 واحد لگاریتمی کاهش یافت. ساختار پنیر از لحاظ محتوای رطوبت، پروتئین، چربی و S+، تفاوت بسیار کمی با پنیرهای تهیه شده از نایسین کپسوله نشده، داشت و فعالیت نایسین در انتهای دوره رسیدن پنیر، 90% فعالیت اولیه بود. بنابراین تولید نانولیپوزوم های حاوی باکتریوسین - نایسین - روش کارآمدی برای رفع این مشکلات می باشد Benech - و همکاران، . - 2003 با توجه به اینکه در سایر روشهای تولید نانو لیپوزوم از حلال های سمی و همچنین از دستگاه هایی مانند سونیکاسیون و هموژنیزاسیون به جهت کاهش در اندازه ذرات استفاده می شود و از آنجایی که مقادیر کمی از این مواد مضر در فاز لیپیدی و یا فاز آبی لیپوزوم باقی میماند و خروج آن عملا ممکن نیست این مشکل امکان استفاده از این نوع حامل را برای اهداف کلینیکی محدود میکند Mozafari - و همکاران، . - 2008 بنابراین در این تحقیق برای تولید و بهینه سازی نانولیپوزومهای حاوی نایسین از روش حرارتی با استفاده از حرارت و با اعمال نیروی بهمزن، بدون استفاده از حلالهای آلی و دستگاه های پیچیده، لیپوزوم هایی در حد نانو تولید شد.
مواد و روشها
در این پژوهش، فسفولیپید گرانولی با درجه خلوص %99 با گرانولهای زرد رنگ از شرکت Acros، آمریکا تهیه گردید. کلسترول پودری با خلوص %95 از شرکت Aldrich ، آمریکا خریداری شد. نایسین پودری با نام تجاری Valisin از شرکت Mayasan، ترکیه تهیه شد. گلیسرول با درجه خلوص %80 از شرکت Merk، آلمان خریداری شد. برای تهیه لیپوزومها، ابتدا فسفولیپد و کلسترول به مدت یک ساعت تحت دمای محیط هیدراته شد. سپس کلسترول در حمام روغنی در دمای 110 درجه سانتیگراد به طور کامل ذوب شد. در مرحله بعد فسفولیپید و کلسترول و ماده ضدمیکروبی مخلوط گردید و در مرحله آخر برای تولید نانولیپوزوم ها، در دمای 60 درجه سانتی گراد، تحت نیروی برشی دستگاه همزن قرار گرفت. به منظور پایداری محلول لیپوزومی به دست آمده، به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق قرار گرفت و سپس در یخچال در دمای 4 c نگهداری شد - Mozafari و همکاران، . - 2008
اندازه گیری قطر ذرات در دستگاه آنالیز کننده اندازه ذرات، مدل Wing Sald 2101، در آزمایشگاه صنعتی دانشکده داروسازی تبریز اندازه گیری شد. سل حاوی آب دو بار تقطیر شده به عنوان مرجع قرار گرفت و پیک های مربوط به آب در اندازه گیری حذف شد. در مرحله بعد، آب دو بار تقطیر با استفاده از سرنگ، از محفظه سل تخلیه شد و محلول مورد نظر برای آنالیز در آن قرار گرفت. باید توجه کرد در این مرحله درب دستگاه حتماً باید بسته شود تا نور لیزر به نمونه تابانده شود.متوسط اندازه ذرات بر اساس میانگین قطر حجمی تعیین شد و کلیه نمونه ها در سه تکرار اندازه گیری شدند.
همچنین برای تعیین کارایی درون پوشانی فرمولاسیون بهینه شده حاصل از مرحله قبل، ابتدا 300 میکرولیتر از فرمولاسیون لیپوزوم، به همراه 1200 میکرو لیتر بافر داخل اپندورف تیوپ ریخته شد و به مدت یک ساعت توسط سانتیفوژ با دور بالا - 14000rpm - سانتی فوژ گردید سپس محلول شفاف بالایی - سوپر ناتانت - را به آرامی جدا کرده Zaerzadeh - و همکاران، - 1390 و میزان پروتیئن در محلول باقی مانده در اپندورف تیوپ توسط کیت اندازه-گیری پروتئین pyrogallol red محاسبه شد. اساس آزمایش به این صورت است که، پروتئینها در حضور molybdate و pyrogallol red تشکیل کمپلکس قرمز رنگ میدهند و رنگ ایجاد شده توسط دستگاه اتو آنالیزور قابل اندازهگیری است Watanabe - و همکاران، . - 1986
کارایی کپسولاسیون طبق فرمول زیر محاسبه شد:
برای انجام آزمایشهای مربوطه از لوازم و دستگاه های شامل: دستگاه اندازه گیری اندازه ذرات SHIMADZU مدل-SALD2101، ساخت ژاپن، همزن مغناطیسی Jenwey1000 ، ساخت انگلستان ، ترازو - AND, EK -2000i - ، بن ماری - - W350B ، کدورت سنج Heydolph مدل TN-100، ساخت آلمان و pH متر HANNA مدل - pH 209 استفاده شد. برای مطالعه تاثیرات غلظت فسفولیپید، دور همزن و زمان فرآیند بر روی اندازه ذرات از طرح آماری Central Compositeاستفاده گردید. برای طراحی آزمایش و آنالیز داده ها از نرم افزار SAS ورژن 9/1 استفاده گردید. نتیجه ها و بحث نانولیپوزوم ها طی زمان دچار رسوب می شوند. این پدیده بر روی اندازه ذرات و همچنین بر روی پایداری ذرات در طول زمان، تاثیر زیادی می گذارد. بنابراین بررسی اندازه لیپوزوم ها یکی از فاکتورهای مهم در بررسی پدیده رسوب، اندازه ذرات می باشد. نتایج تجزیه و تحلیل واریانس اندازه ذرات لیپوزوم در مرحله بهینه سازی در جدول - 1 - نشان داده شده است.
مدل به دست آمده برای پیش بینی تاثیر سرعت همزدن - X1 - ، غلظت فسفولیپید - X2 - ، زمان همزن - X3 - بر روی اندازه ذرات لیپوزوم با حذف عوامل غیر معنی دار به صورت زیر به دست می آید. شکل - 1 - تاثیر سطوح مختلف غلظت و سرعت همزن را روی میانگین اندازه ذرات لیپوزوم - نانومتر - نشان می دهد. همانطور که در نمودار ملاحظه می-شود، کاهش سایز ذرات در کمترین مقدار غلظت فسفولیپید و در بیشترین مقدار دور همزن حاصل می شود. این نتایج با نتیجه Schrooyen و همکاران - 2001 - مطابقت دارد. این محققان در تحقیقات خود به این نتیجه رسیدند که تشکیل لیپوزوم ها نیاز به انرژی دارد و بسته به نوع لیپوزوم تشکیل دهنده، انرژی درونی مورد نیاز بسیار متفاوت می باشد. وزیکولهای بزرگ چندلایه در اثر همزدن ملایم تشکیل می شوند در حالی که وزیکولهای لیپیدی کوچکتر، با افزایش سرعت همزن تشکیل می شوند.
