بخشی از مقاله
چکیده:
اسکن میکروسکوپی لیزری هم کانون - CLSM - ، ابزاری مفید در بدست آوردن تصاویر کانونی سه بعدی از یک عمق انتخاب شده از یک نمونه با کیفیت بالا می باشد. این تکنیک به طور گسترده در مطالعات بیولوژیکی - مانند میکروبیولوژی، ژنتیک - ، علم پزشکی و صنایع غذایی مورد استفاده قرار می گیرد .
اجسام بیولوژیکی جهت شناسایی در زیر میکروسکوپ باید توسط شناساگرهای فلورسنت برچسب زده شوند . از کاربردهای CLSM می توان به بهبود ساختار کف، درک بهتر از ساختار حباب و ثبات در صنعت محصولات غذایی و آشامیدنی، ارزیابی اثر زیست کش ها و افزایش عمر ماندگاری مواد غذایی و آنالیز تغییرات در ریزساختارهای غذا که در نتیجه رهیاب موثری در مناسب کردن محصولات غذایی می باشد، اشاره نمود.
مقدمه:
اساس میکروسکوپ هم کانون ابتدا" توسط ماروین مینسکی در سال 1961اختراع شد. به دنبال کار مینسکی، دیوید اِگِر و مُجمیر پتران میکروسکوپ هم کانون چند پرتویی را در اواخر دهه 1960 ساختند. در طی اواخر دهه 1970 و 1980، تکنولوژی لیزر و کامپیوتر پیشرفته شد.
اسکن میکروسکوپی لیزری هم کانون 1 - CLSM - ، بر خلاف میکروسکوپ نوری با فیلد وسیع، روشی برای به دست آوردن تصاویر نوری با وضوح بالا با انتخاب عمق می باشد
ویژگی کلیدی میکروسکوپ هم کانون، توانایی آن در بدست آوردن تصاویر کانونی از عمق انتخاب شده از نمونه مورد نظر است؛ که به این فرایند برش نوری گویند. اصطلاح برش نوری به توانایی ابزار بر می گردد که می تواند تصاویر واضح از سطوح کانونی عمیق با ضخامت مختلف را تولید کند بنابراین برش های نوری نازک 0/5 - تا 1/5 میکرومتر - به صورت سریالی از عمق های مختلف نمونه تهیه کرده و دیگر نیازی به برش های نازک با استفاده از ابزارهایی مانند میکروتوم نیست.
همچنین برش های نوری آرتیفکت هایی که در طی برش های فیزیکی و رنگ آمیزی با فلورسنت نمونه بافتی که در میکروسکوپ های مرسوم رخ می دهد، را حذف می کند. با استفاده از تکنیک های فیلتر کننده ویژه، پرتوهای رسیده از خارج از کانون مورد نظر، حذف می گردد.
CLSM، برش های نوری را به صورت نقطه به نقطه با استفاده از پرتو لیزر متمرکز شده بر روی نمونه، اسکن می کند و تصاویر تشکیل شده توسط یک کامپیوتر به صورت سه بعدی بازسازی می گردد. کیفیت تصاویر بدست آمده در تصویر برداری داخلی با این تکنیک نسبت به میکروسکوپ ساده، بسیار بیشتر است؛ زیرا تصویری که از اعماق مختلف نمونه تشکیل می شود، بر روی هم قرار نمی گیرند . در میکروسکوپ نوری معمولی تا جایی که نور در نمونه توانایی نفوذ دارد می توان نمونه را بررسی کرد، در حالیکه در میکروسکوپ هم کانون می توان تصاویر را از یک عمق کنترل شده به طور موثری رویت کرد
میکروسکوپ هم کانون، به طور غیر تهاجمی، برش نوری متوالی از نمونه های زنده، به صورت ضخیم و با حداقل آماده سازی نمونه، فراهم می کند که به دلیل ابزار شناساگر فتون با کوانتوم موثر، استفاده از آینه های منعکس کننده کارا تر، لنزهای با قابلیت انتقال نور بالا و کامپیوتر با سخت افزار و نرم افزار بهتر می باشد بنابر این اختلال در بررسی های نمونه های حساس به برش مثل محصولات لبنی، پنیرهای نرم اهمیت ویژه ای دارد در حالیکه تکنیک های میکروسکوپی دیگر باعث قطع فیزیکی نمونه می شوند.
تشکیل تصویر:
در یک CLSM ، پرتو لیزر از بین یک روزنه نوری عبور کرده و توسط یک عدسی شیئی بر روی سطح نمونه متمرکز می شود. نمونه ها خصوصا در کاربردهای بیولوژیکی، فلورسنت می باشند. نور لیزر بازتابیده شده از نمونه به همراه نور فلورسنت منعکس شده از آن دوباره توسط عدسی شیئی جمع آوری می شود . یک شکاف دهنده پرتو، قسمتی از نور را به دستگاه شناسایی کننده منتقل می کند که در میکروسکوپ فلورسنس هم کانون، دارای فیلتری است که به طور انتخابی طول موج های فلورسنت را عبور می دهد در حالی که طول موج تحریکی اولیه را مسدود می کند.
دستگاه شناسایی کننده، نورهایی را که از یک نقطه کانونی نمی آیند، مسدود می کند و در تصویر به صورت خط خاکستری نشان داده می شود؛ در نتیجه تصاویر دقیق تری نسبت به تصاویر تکنیک های میکروسکوپی فلورسنس مرسوم ایجاد می شود. از آنجایی که لیزر تمام صقحه را اسکن می کند، تصویری کامل، به صورت پیکسل به پیکسل و خط به خط بدست می آید. هر چه سرعت اسکن آهسته تر باشد، نسبت سیگنال به خطا، کمتر می شود و در نتیجه وضوحیت تصویر بیشتر خواهد شد . در نهایت در ابزار شناسایی فتون، سیگنال نوری به سیگنال الکتریکی تبدیل شده و این سیگنال توسط یک کامپیوتر ثبت و آنالیز شده و یک تصویر سه بعدی از نمونه تهیه می گردد.
آماده سازی نمونه :
نمونه های بیولوژیکی اغلب با رنگ های فلورسنت آماده سازی می شوند تا به خوبی قابل مشاهده شوند. اگرچه غلظت رنگ واقعی می تواند کم باشد تا اختلالی در سیستم های بیولوژیکی ایجاد نکند. رنگ های روشن تر و کمتر توکسیک برای تصویر برداری از سلول های زنده توسعه یافته است مثلا پروتئین فلورسنت سبز رنگ - GFP - که پروب بسیار مفیدی جهت بیان ژن در سلول های زنده می باشد
جهت نشانه گذاری هر جزء سلول، از پروب فلورسنت اختصاصی استفاده می گردد مثلا برای نشانه گذاری غشاء سلول از رنگ رودامین پالوئیدین، برای هسته سلول از ToPro، برای دستگاه گلژی از .Bodipy ceramide پروب های فلورسنت از مواد شیمیایی آلی آروماتیک سنتزی ساخته می شوند که به ماکرومولکول های بیولوژی مانند نوکلوئیک اسید و پروتئین متصل شده یا در میان مناطق ساختاری مثل میتوکندری، اسکلت سلولی، هسته، دستگاه گلژی قرار می گیرند
سایر پروب ها جهت آگاهی از فرایند های دینامیک و متغییرهای محیطی مانند غلظت فلزات سنگین، pH، پتانسیل غشایی به کار گرفته می شود. - . - Lemasters et al., 1999 رنگ های فلورسنت همچنین جهت آگاهی از تمامیت سلول - زنده بودن یا مرگ سلول - ، فرایند های اندوسیتوز، اگزوسیتوز، سیالیت غشا، انتقال سیگنال و فرایندهای آنزیمی به کار رفته و به طور گسترده ای در نقشه برداری ژنتیکی و آنالیز کروموزوم در حیطه ژنتیک مولکولی اهمیت دارند.
کاربردها :
-1 مشاهده همزمان ریز ساختارهای پیچیده انواع مختلف مواد غذایی بخصوص محصولات لبنی. که به فهم بهتر محصولات غذایی و عملکرد عناصر آنها کمک می کند که در نتیجه رهیافت موثری در نگه داشتن پایداری و مناسب کردن احساس دهانی محصولات غذایی و بهینه کردن روند تولید آنها می باشد. مثلا در مطالعه ای دو جزء چربی و پروتئین و میزان گسترش هر کدام از آنها را در شیر خشک و پودر هایی که با روغن ماهی انکپسوله شده اند، مورد بررسی قرار گرفت و از ترکیب رنگ های نایل بلو، نایل رد و رودامین B برای شناسایی آنها استفاده شد. نتایج بیان کردند که پودرهای حاوی اسید چرب آزاد زیاد لزوما سطح بالایی از چربی سطحی را نداشته اند ولی قطرات چربی زیادی در اجزاء پودر رویت شد.
همچنین خواص انعقادی عوامل پروتئینی بر بافت و طعم غذا اثر گذاشته که از CLSM جهت مشاهده انعقاد پروتئین های شیر، غلظت های پروتئن آب پنیر و بتا لاکتا گلوبولین استفاده می شود.
-2 می توان شناسایی تغییرات در ریز ساختارهای غذا در طی پردازش و غذا خوردن کرد. مثلا اثر پردازش مانند گرم کردن، مخلوط کردن، هموژن و هوادهی کردن بر روی ریز ساختار غذا، به طور گسترده ای پایداری محصول را تعیین می کند.
-3 با آنالیز ریز ساختارهای غذا و ایجاد تغییرات در آن، می توان به بهبود فرمولاسون محصولات غذایی و پردازش آنها، طراحی غذاهای سالم دیگر و همچنین فهم علل پایداری محصولات غذا که باعث افزایش عمر ماندگاری آنها می گردد، کمک کرد.
-4 میزان جمعیت میکروبی را می توان در بعضی غذا ها ارزیابی کرد. مثلاگسترش باکتری بِرِوی باکتریوم و کپک جئوتریکوم را در اسمیر پنیر گوبی جهت شناسایی میزان رسیدن آن، می توان مورد مطالعه قرار داد
-5 می توان مقدار باکتری فسادزا یا بیماری زا را در مواد غذایی شناسایی و تعیین نمود. مثلا در مطالعه ای محل لوکالیزه شدن Ecoli 0157:H7 را با استفاده از CLSM در گوشت گاو، هویج، پنیر نرم بدست آمده از شیر پاستوریزه بررسی کرده اند. نتایج نشان دادند که چگونه این باکتری می تواند از سطح این مواد غذایی عبور کند و به محلی که نسبت به مواد ضدعفونی کننده محافظت می شوند، نفوذ کنند.
-6 درک بهتر از ساختارهای حباب و ثبات در صنعت مواد غذایی و آشامیدنی
-7 بهبود ساختار کف و مورفولوژی در علم مواد
-8 ارزیاب اثر زیست کش ها بر جمعیت میکروبی
-9 شناسایی ویژگی فیلم تشکیل دهنده پلی مر ها به عنوان ابزار توسعه در صنعت پوشش
-10 کاربرد وسیع در علم بیولوژی - بیولوژی زیستی، ژنتیک، میکروبیولوژی، بیولوژی تکوینی -
-11 به طور بالینی جهت ارزیابی بیماری های چشم، بخصوص برای تصویربرداری و آنالیز کیفی و کمی سلول های اندوتلیال قرنیه استفاده می شود
