بخشی از مقاله
چکیده
سلولهای بنیادی خونساز گروهی از سلولهای ناهمگن با ویژگی خودنوسازی، قابلیت تمایز و پتانسیل بازسازی هستند. گروهی از این سلولها، سلولهایی هستند که نشانگر سطح سلولی CD117 را بیان میکنند و اصطلاحاً سلولهای C-Kit+ نیز نام دارند. مطالعات مختلف نشان دادهاند که حضور این سلولها برای عملکرد سلولهای بنیادی خونساز مورد نیاز و ضروری است به طوریکه جهشهایی که منجر به فعالیت زیاد و عدم فعالیت این سلولها و گیرندههای سطح سلولی این سلولها میشود به شدت بر عملکرد سلولهای بنیادی خونساز تأثیرگذار هستند. به همین منظور و با توجه به اهمیت نقش این سلولها در خونسازی هدف از این مطالعه بررسی پروتوکل جداسازی این سلولها با روش MACS و شناسایی این سلولها با روش FACS میباشد.
به این منظور، پس از معدوم کردن موشهای رت نژاد رتوس، استخوانهای فمور و تیبیا جدا و به آزمایشگاه کشت سلولی منتقل شد. در مرحله اول محتویات مغز استخوان فلاشینگ شد، در مرحله دوم سلولهای تک هستهای با روش فایکول-هایپک جمعآوری شد و در مرحله آخر سلولهای CD117+ با روش MACS جداسازی شد. جهت تأیید سلولهای جدا شده میزان بیان نشانگر سطح سلولی CD117+ با روش فلوسایتومتری اندازهگیری شد. نتایج حاصل از جداسازی سلولهای CD117+ نشان داد که 90 درصد سلولهای جدا شده از سلولهای تک هستهای مغز استخوان، نشانگر CD117+ را بیان میکنند. این مطالعه نشان میدهد که سلولهای CD117+ به راحتی قابل جداسازی، شناسایی و ذخیره سازی جهت انجام مطالعات آزمایشگاهی هستند.
کلمات کلیدی: سلولهای بنیادی CD117+، جداسازی و شناسایی، مغز استخوان رت
-1مقدمه و هدف
مغز استخوان دارای سلولهای بنیادی میباشد که خونساز بوده و از منشاء سلولهای مزانشیمی میباشند. ویژگی خونسازی یعنی تولید و نگهداری سلولهای بنیادی خونی و تکثیر و تمایز آنها به سلولهای خون محیطی. سلولهای بنیادی مغز استخوان بیش از انتظار توانایی دارند زیرا آنها چند توان میباشند و توان تمایز به بسیاری ازسلولها در شرایط In vitro و In vivo را دارند بطوریکه این سلولها پیشساز سلولهای قرمز خون، سلولهای سفید خون و پلاکتها بوده و قادرند در مواقع تخریب مغز استخوان جایگزین آن شده و سلولهای بالغ خونی را تولید کنند. بنابراین استفاده از انواع سلولهای بنیادی که از بافتهای مختلف بدن قابل جداسازی هستند میتواند افق روشنی در درمان انواع بیماریها باشد.
-2تئوری و پیشینه تحقیق
مطالعات گذشته استفاده از سلولهای پروژنیتور و بنیادی و اینکه این سلولها میتوانند منبع مناسبی در سلول درمانی باشند را نشان دادهاند. در گروه سلولهای پروژنیتور، تمامی انواع این سلولها، جداسازی و شناسایی آنها گزارش نشده است. به این منظور در این مطالعه به جداسازی و شناسایی یک گروه مهم از سلولهای بنیادی خونساز که نشانگر CD117 را در سطح سلولهای خود بیان میکنند و جزء سلولهای پروژنیتور هستند خواهیم پرداخت.
-3 مواد و روشها
1؛-3 جداسازی و کشت سلولهای پروژنیتور CD117 +
پس از اخذ موافقت از کمیته اخلاق، 5 عدد رت گونه رتوس خریداری شد و در مرکز کاربردی دارویی دانشگاه علوم پزشکی تبریز، با تزریق داخل صفاقی کتامین -زایلازین، موهای ناحیه جراحی تراشیده شد درو شرایط کاملاً استریل، استخوانهای ران و درشت نی جدا شدند. بافت نرم و عضلات اطراف آنها به طور کامل پاک شد و در داخل بافر ٌPBS استریل به آزمایشگاه کشت سلولی منتقل شد تا سلولهای پروژنیتور CD117+ استخراج و سایر آزمایشها صورت گیرد. جهت جداسازی سلولهای پروژنیتور CD117+ مغز استخوان، ابتدا سلولهای تک هستهای مغز استخوان با استفاده از روش فایکول-هایپک جمعآوری شده و سپس با استفاده از روش MACS2 سلولهای پروژنیتور CD117+ استفاده شد.
2؛-3 جمعآوری سلولهای تک هستهای مغز استخوان به روش فایکول-هایپک
استخوانهای ران و درشت نی جدا شده از مرحله قبل، از ناحیه اپیفیز بریده شد و با سرنگ حاوی PBS محتویات مغز استخوان فلاشینگ شد. در مرحله بعد محتویات مغز استخوان به داخل فالکون 50 ریخته شد و با PBS حاوی آنتی بیوتیک پنی سیلین-استرپتومایسین و 5 درصد سرم جنین گاو شستشو داده شد. رسوب سلولی به دست آمده از این مرحله، بر روی فالکون حاوی هم حجم فایکول ریخته شد و با دور1500 rpm به مدت 30-20 دقیقه سانتریفیوژ شد. در این مرحله سه فاز تشکیل شده است، که فاز میانی که شامل سلولهای تک هستهای میباشد به آرامی برداشته شد و با PBS شستشو داده شد.
-3-3 جداسازیَ سلولهای پروژنیتور CD117 + با روش MACS
سلولهای تک هستهایی مغز استخوان بدست آمده از مرحله قبل پس از شستشو، با دور 250×g به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد و به مقدار 100 مایکرولیتر ازFCR blocking برروی سلولها و به مدت چند ثانیه ورتکس شد. در ادامه، به مقدار 100 مایکرولیتر از c-kit+ micro bead به سلولها اضافه شد و پس از ورتکس به مدت 30 دقیقه در داخل یخچال انکوبه شد و جهت جلوگیری از ته نشین شدن micro beadها هر 5 دقیقه یکبار محتوی فالکون ورتکس شد. پس از اتمام زمان انکوباسیون به سلولها 10ml بافر شستشو اضافه و به مدت 10 دقیقه با دور 350×g سانتریفیوژ شد. ستونهای مخصوص MACS در داخل دستگاه قرار داده شد و پایین آن لوله فالکون نام گذاری شده - labeled - به عبارت دیگر - CD117 قرار داده شد.
سپس سلولهای رنگ شده با 3ml بافر شستشو رقیق و از داخل لوله عبور داده شدبعد با 3ml دیگر از بافر شستشو لوله فالکون حاوی سلولها شستشو داده شد. بدین ترتیب لوله فالکون زیر ستون حاوی سلولهای c-kit- است و سلولهای CD117+ در داخل ستون به دام افتاده است. بعد ستون به آرامی از دستگاه جدا شده به اندازه 3ml؛4 بافر شستشو در داخل ستون ریخته شد. با پیستون موجود در کیت محتویات ستون به داخل لوله فالکون نام گذاری شده به نام CD117+ تخلیه شد و در پایان سلولهای حاصل به مدت 10 دقیقه با دور 250×g سانتریقیوژ شد.پس از جداسازی سلولها، سلولها به وسیله دستگاه فلوسایتومتری تعیین هویت شدند.
-3-4تعیین هویت سلولها به روش فلوسایتومتری
برای این منظور سلولهای پروژنیتور CD117+ جدا شده از مرحله قبل سه مرتبه با PBS شستشو داده شد. سپس آنتی-بادی مربوط به CD-117 کونژوگه شده با FITC به محیط افزوده شده و به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه انکوبه شد. نمونههای حاصل با استفاده از دستگاه فلوسیتومتر مورد ارزیابی قرار گرفتند.
-3-5آزمایش تعیین درصد زنده بودن سلولها
پس از جداسازی سلولهای مذکور آزمایش تعیین درصد زنده بودن سلولها بر روی سلولها انجام گرفت به این صورت که پس از شستشوی سلولها با PBS، آزمایش تریپانبلو به منظور تعیین تعداد و درصد سلولهای زنده در شمارش کل سلول-ها انجام می شود. رتگ تریپانبلو جزء رنگهایی است که سلولهای زنده قادر به مقاومت در برابر ورود رنگ بوده و سیتوپلاسم شفاف باقی میماند اما رنگ به داخل سلولهای مرده نفوذ میکند و سیتوپلاسم به رنگ آبی درمیآید.
-4 نتایج
-4-1نتایج مربوط به جداسازی سلولهای بنیادیCD117+
سلولهای جداشده با نشانگر سطحی 117، همانند سایر سلولهای بنیادی خونساز به صورت شناور و غیر چسبنده هستند. به علاوه نتایج مربوط به شمارش سلولی نشان داد که از حدود 500 میلیون سلول تک هستهای مغز استخوان، تنها 11 میلیون سلول با نشانگر سطح سلولی CD117+ جداسازی شد و این مطلب بیانگر این است که تنها 0.45 درصد از سلولهای مغز استخوان را این سلولها تشکیل میدهند.
-4-2 نتایج مربوط به شناسایی سلولهای بنیادی CD117+
نتایج این مطالعه نشان داد که 90 از سلول های جدا شده نشانگر CD117 را بیان میکنند.
-5نتیجه گیری
نتایج نشان داده که روش MACS یکی از تکنیکهایی است که به طور گسترده میتواند جهت جداسازی سلولهای CD117+ قابل استفاده باشد.
-6سپاسگزاری
این مقاله برگرفته از گرنت تحقیقاتی دانشگاه تبریز میباشد.
-7پیشنهادات
پیشنهاد میشود که سلولهای با نشانگر سطح سلولی CD117 یا CD117+ از سایر بافتها جداسازی شود.
