بخشی از مقاله
چکیده
تمامی بافتها از سلول بنیادی منشأ میگیرند، این سلولها گروهی از سلولهای تمایز نیافته هستند که توانایی خود نوسازی دائم و نامحدود را دارند و تحت شرایط آزمایشگاهی خاص، میتوانند انواع سلولهای سوماتیک بالغ را ایجاد کنند. به تازگی سلولهای بنیادی مزانشیمی بهعنوان گزینه برتر در امر ژندرمانی و سلول درمانی به خوبی شناخته شدهاند. امروزه بیماریهای خونی متعددی از قبیل تالاسمی، سایر کم خونیها و انواع لوسمیها جامعه بشری را رنج میدهند. از جمله بیماریهایی که توسط سلولهای بنیادی به روش پیوند درمان میشود، لوسمی میلوئیدی مزمن ٌ - CML - است.
CML یک بیماری کلونال در اثر ناهنجاری ژنتیکی از نوع جابجایی کروموزومی بین ژن abl - کروموزوم - 9 و ژن bcr - کروموزوم - 22 در سلولهای خونساز مغز استخوان ایجاد میشود. امروزه روش پیوند مغز استخوان، مؤثرترین روش درمان CML میباشد. یافتن مکانیسمها و نقش مولکولهای دخیل در عمل پیوند، کمک شایانی در پیشآگهی و درمان در اختیار محققان و پزشکان میگذارد.
هدف این مطالعه اسخراج سلولهای بنیادی مزانشیمی از بافت مغز استخوان، بررسی نشانگرهای سطح سلولی به روش فلوسایتومتری جهت تأیید مزانشیمال بودن سلولها و بررسی اثر تعاملی این سلولها با سلولهای همکشت شده CML به روش Cytokine assay میباشد. نتایج به دست آمده از فلوسایتومتری نشان داد که سلولهای بنیادی مزانشیمی مستخرج از بافت مغز استخوان نشانگرهای اختصاصی سلول های بنیادی مزانشیمی CD73 - و - CD90 را بیان میکردند و همچنین نشانگرهای اختصاصی سلول های هماتوپوئتیک CD34 - و - CD45 را در سطح خود بیان نکردند.
نتایج حاصل از Cytokine assay حاکی از آن است که سایتوکاین TIMP-1 از جمله سایتوکاین و فاکتورهای ترشحی سلولهای بنیادی مزانشیمی میباشد که در همکشتی با سلولهای لاین CML شناسایی شد. این مطالعه نشان می دهد که TIMP-1 می تواند به عنوان عامل مؤثر در القاء آپاپتوز سلولهای لاین CML در سلول درمانی و پیوند باشد.
.1 مقدمه
سرطان دومین عامل مرگ ومیر در دنیا است. طبق پیش بینی سازمان بهداشت جهانی موارد ابتلاء به سرطان از 10 میلیون مورد جدید در سال 2000 به 15 میلیون مورد جدید در سال 2020 افزایش خواهد یافت در بسیاری از کشورها بیش از 25 درصد مرگها ناشی از سرطان میباشد. این گزارش زنگ خطر را برای دولتها، پزشکان و مسئولان بهداشتی به صدا در آورده است و جامعه جهانی باید قدمهای جدیتر را برای مقابله با آن بردارد. امروزه فهم و ادراک ما نسبت به سرطان، نحوه ایجاد و پیشرفت آن و مکانیسمهای درگیر در بیماری زایی آن بیشتر شده است.
در این میان انواع سرطان خون سالانه تعداد زیادی از مرگ و میرهای مربوط به سرطان را به خود اختصاص میدهند. لوسمی میلوئید مزمن - CML - حاصل یک ناهنجاری کروموزومی به نام کروموزوم فیلادلفیا - ph - است که از جابجایی بین کروموزوم های 9 و 22 ناشی شده است و نتیجه آن ایجاد ژن نوترکیب - BCR-ABL - است .[1] محصول پروتئینی این ژن نوترکیب دارای فعالیت تیروزین کینازی است و سبب گسترش رده میلوئیدی میگردد. CML تقریبا 15 درصد از کل لوسمیها و 20-7 درصد از لوسمیهای بالغین را تشکیل میدهد
اگرچه CML در مقایسه با سرطانهای شایع و کشنده انسان مثل سرطان ریه، پروستات، پستان و... از شیوع کمتری برخوردار است اما درجه کشندگی آن بیشتر است. بنابراین یافتن روش درمانی و مکانسیم عمل آن باعث افزایش درصد بهیود بیماران خواهد شد. این بیماری به سه فاز مزمنٌ، شتاب گیرندهٍ و بلاستیکَ تقسیم میشود.[3] در بافت مغز استخوان سلولهای مهم از جمله سلولهای بنیادی و پیش ساز سلولهای خونی مختلف و سلولهای بالغ ایمنی دیده می شوند.
بخش مهمی از سلولهای ایمنی موجود در مغز استخوان در سلولهای تک هستهای آن حضور دارند. به طور کلی در مغز استخوان سلولهایی به نام سلولهای ریشهای چند ظرفیتی وجود دارد که دو نوع سلول از آنها جدا میشود. الف - سلول-های رده لنفوئیدی که لنفوسیتهای نوع B و T را میسازند. ب - سلولهای رده میلوئیدی که این سلولها در مسیر تکاملی خود تبدیل به چندین نوع سلول میشوند. این سلولها از آن جهت که در محیط کشت قادر به تشکیل کلنی هستند به نام واحدهای کلنی ساز - CFU - شناخته میشوند این سلولها عبارتند از :
سلولهای کلنی ساز که رده مگاکاریوسیتی را میسازند و در نهایت پلاکتها را بوجود میآورند. سلولهای کلنی ساز که ردههای گرانولوسیت و مونوسیت را میسازند.
سلولهای کلنی ساز که رده ائوزینوفیلی را میسازند. واحد کلنی ساز سازنده رده بازوفیلی.
واحد کلنی ساز که رده اریتروئیدی را میسازند. این سلولها در نهایت گلبولهای قرمز را بوجود میآورند.
از میان سلولهای تک هستهای موجود در مغز استخوان، 0/001 تا 0/1 درصد از جمعیت سلولهای هسته دار مغز استخوان انسان را سلولهای بنیادی مزانشیمی تشکیل میدهند، که توانایی ازدیاد و تکثیر در محیط آزمایشگاهی به صورت سلولهای چسبنده شبه فیبروبلاستی به کف ظروف پلاستیکی را به خوبی نشان میدهند. تاکنون برای این سلولها نشانگر خاصی به دست نیامده است ولی این سلولها فاقد نشانگرهای هماتوپویتیک CD10،CD13 ، CD14، CD34، CD45 و همچنین فاقد نشانگرهای اندوتلیال CD34، CD31 هستند و شاخصهای سلولهای استرومایی SH-2، Sh-3 ، SH-4 و گیرندههای سایتوکینی مثل گیرنده انترلوکین - IL1-R - 1 و گیرنده TNF را هم بیان میکنند.
سلولهای بنیادی مزانشیمی توانایی تبدیل شدن به سلولهایی از رده-های مختلف را در شرایط آزمایشگاه نشان دادهاند. جداسازی و تکثیر به نسبت راحت و اتولوگ بودن سلولهای مزانشیم آنها را کاندید مناسب برای سلول درمانی ساخته است. سلولهای بنیادی، سلولهای تمایز نیافته با توانایی تکثیر و تولید سلولهای تمایز یافته هستند. در صورت شرایط محیطی مناسب In vivo یا In vitro ، سلولهای بنیادی مزانشیمی میتوانند به چندین دودمان سلولی از جمله استخوان، عصب، غضروف و کبد تمایز یابند.
تحقیقات انجام شده بر روی بافتهای همبندی بالغین نشان دادهاند که اکثر سلول های بنیادی مشتق از بافت همبندیُ سلولهای بنیادی مزانشیمی ِ - MSCs - هستند. این سلولهای مزانشیمی اولین بار از مغز استخوان بدست آمدند و مشخص شد که سلولهای بنیادی مشتق از مغز استخوان میتوانند در صورت وجود شرایط مناسب انواع متعددی از سلولها مانند سلولهای عضله اسکلتی، ماهیچه قلبی، کبد، بافتهای عروقی و عصبی، غضروف و دیگر بافتها را تولید کنند.
مشخص شده است که فاکتورها و سایتوکاینهای مترشحه از سلولهای بنیادی عامل اصلی و مهم تأثیر این سلولها میباشند. در این پژوهش، هدف تعیین نوع فاکتورو سایتوکاینهای مترشحه از سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان رت بر رده سلولی لوسمی میلوئیدی مزمن که به روش همکشتی در مجاورت یکدیگر قرار گرفتهاند به عنوان عاملی در درمان لوسمی میلوئید مزمن است.
.2 مواد و روشها -1-2 استخراج و کشت سلولهای بنیادی مزانشیمی از مغز استخوان
پس از اخذ موافقت از کمیته اخلاق، 5 عدد رت گونه رتوس خریداری شد و در کلینیک تخصصی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تبریز، جراحی و استخوان رانّ و درشتنیْ جدا شد. پس از بیهوشی با تزریق داخل صفاقی کتامین-زایلازین، موهای ناحیه جراحی تراشیده شد ودر شرایط کاملاً استریل، استخوانهای ران و درشت نی جدا شدند. بافت نرم و عضلات اطراف آنها به طور کامل پاک شد و در داخل بافر ٌPBS استریل به آزمایشگاه کشت سلولی منتقل شد تا سلولهای بنیادی مزانشیمی استخراج و سایر آزمایشها صورت گیرد. جهت جداسازی سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان از روش فایکول-هایپک استفاده شد. پس از جداسازی سلولها، سلولها در انکوباتور قرار گرفتند و اولین تعویض محیط 72 ساعت پس از به دست آوردن سلولها انجام شد تا سلولهای غیر چسبنده جدا گردند. پس از این مرحله محیطهای کشت سلولها هر سه روز یکبار تعویض شدند. این مرحله تا افزایش سلولها ادامه یافت.
-2-2تعیین هویت سلولها به روش فلوسایتومتری
برای این منظور سلولهای بنیادی بافت مغز استخوان پاساژ 4 را با استفاده از تریپسین 0/2 درصد از فلاسک کشت جدا نموده و سه مرتبه با PBS شستشو داده شد. سپس آنتیبادیهای همراه با FITC ضد CD73، CD90، CD45و CD34 به محیط افزوده شده و به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه انکوبه شدند. نمونههای حاصل با استفاده از دستگاه فلوسیتومتر مورد ارزیابی قرار گرفتند.
-3-2آزمایش تعیین درصد زنده بودن سلولها
پس از خریداری سلولهای رده سلولی لوسمی میلوئیدی مزمن - K562 - ، این سلولها کشت داده شدند. آزمایش تعیین درصد زنده بودن سلولها بر روی هر دو سلول بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان و K562 انجام گرفت به این صورت که پس از تریپسینه کردن و شستشوی سلولها با PBS، آزمایش تریپانبلو به منظور تعیین تعداد و درصد سلولهای زنده در شمارش کل سلولها انجام می شود. رتگ تریپانبلو جزء رنگهایی است که سلولهای زنده قادر به مقاومت در برابر ورود رنگ بوده و سیتوپلاسم شفاف باقی می-ماند اما رنگ به داخل سلولهای مرده نفوذ میکند و سیتوپلاسم به رنگ آبی درمیآید.
-4-2همکشتی سلولهای K562 با سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان
برای انجام همکشتی از پلیت مخصوص همکشتی Transwell با قطر منافذ µ 4/0m استفاده شد. این پلیت دارای دو محفظهی مجزا بوده که توسط غشای نیمه تراوا از یکدیگر جدا شدند. سلولهای K562 و سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان در دو محفظه، جدا از هم قرار گرفتند. عوامل ترشحی از محفظهای به محفظهی دیگر وارد میشوند. در این همکشتی، سلولهای K562 بدون تماس فیزیکی با سلولهای بنیادی مزانشیمی، در معرض مواد ترشحی و سیتوکینهای تولید شده توسط سلولهای بنیادی قرار گرفتند.
-5-2تعیین پروفایل سایتوکاین
برای انجام این روش، محیط کشت سلولهای هم کشت شده K562 و بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان پس از 7 روز هم کشتی و سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان به تنهایی جمعآوری میشود و با استفاده از پروتوکل موجود در کیت سایتوکاین اریٍ پروفایل سایتوکاینی تعیین خواهد شد.
.3 نتیجهگیری -1-3کشت سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان رت
سلولهای غیر چسبنده در طی تعویض محیط و نیز در روند پاساژ سلولی از ظروف کشت حذف گردیدند. به طور طبیعی سلولهای بنیادی برگرفته از بافت چربی در طی 5-4 روز به 90-80 درصد تراکم رسیدند. سلولهای بنیادی مزانشیمی در محیط کشت دارای ظاهری دوکی و شبه فیبروبلاستی بودند
شکل-:1 نمای دوکی شکل و شبه فیبروبلاستی سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان رت
