بخشی از مقاله
نقش سلول هاي مايلومايي در فعاليت سلول هاي استئوکلاست
* هدف : بررسي نقش سلول هاي مايلومايي در فعاليت سلول هاي استئوکلاست
* مواد و روش ها: در اين مطالعه نمونه خون محيطي و مغزاستخوان ٧ بيمار مبتلا به مايلوما ولوسمي پلاسماسل و نيز٤ نوع رده سلولي به عنوان نمونه کنترل از نظر بيان (RANK)Receptor Activator of Nuclear Factor kB و (RANKL)Receptor ctivator of Nuclear Factor kB ligand بررسي شد.RNA نمونه ها با استفاده از روش گوانيدين تيوسيانات از سلول هاي تک هسته اي به دست آمده از نمونه بيماران استخراج گرديد. پس از انجام کنترل کيفي جهت ارزيابي وضعيت بيان RANK.RANKL از واکنش (PCR RT)Polymerase Chain Reaction Reverse Transcriptions استفاده شد.
* يافته ها: در اين مطالعه با استفاده از تکنيک PCR RT نشان داده شد که U-266 (رده سلول مايلومايي ) و پلاسماسل هاي جدا شده از بيماران مبتلا به مالتيپل مايلوما RANK و RANKL رادر سطح mRNA بيان مي کنند.
* نتيجه گيري : نتايج نشان مي دهد که به احتمال زياد بيان RANK و RANKL توسط پلاسماسل ها مي تواند در القاي فعاليت استئوکلاست ها و پلاسماسل ها و متعاقب آن افزايش تخريب استخوان در بيماران مبتلا به مايلوما نقش مهمي داشته باشد.
* کليدواژگان : مالتيپل مايلوما، بيماري استخواني ، RANKL،RANK
مقدمه
اختلالات پلاسماسل شامل طيف وسيعي از بيماري ها مي باشند که برخي از آنها عبارتند از: مالتيپل مايلوما (;Multiple Myeloma MM)، مونوکلونال گاماپاتي با اهميت نامشخص ، آميلوييدوزيس اوليه و بيماري هاي زنجيره سبک وسنگين ايمونوگلوبولين (١).ازجمله مهم ترين ويژگي هاي اين اختلالات ، تکثير و تجمع پلاسماسل هاي کلونال در مغز استخوان و حضور مقادير و انواع متفاوتي از ايمونوگلوبولين مونوکلونال در سرم و يا ادرار بيماران مي باشد (٢، ٣).
در ميان اختلالات پلاسماسل ، مالتيپل مايلوما (MM) دومين سرطان شايع خون پس از لنفوم مي باشد. مالتيپل مايلوما بدخيمي مربوط به لنفوسيت هاي B تمايز يافته (پلاسماسل ها) مي باشد. برخي از مهم ترين مشخصات اين بيماري عبارتند از: تکثير و تجمع پلاسماسل هاي کلونال در مغز استخوان ، حضور ايمونوگلوبولين مونوکلونال در سرم و يا ادرار و ايجاد ضايعات استخواني ليتيک در جمجمه ، استخوان هاي لگن ، ران و غيره . برخلاف دست يابي به پيشرفت هاي نوين درماني ، مالتيپل مايلوما همچنان به صورت يک بيماري غيرقابل درمان در نظر گرفته مي شود.
هر سال حدود ١٥٠٠٠ نفر به اين بيماري مبتلا مي شوند.ميانگين سني در زمان تشخيص بين ٦٥-٦٠ سالگي مي باشد، در زمان تشخيص کمتر از ٢درصد، مبتلايان به مايلوما سن کمتر از ٤٠ سال دارند. اين طور به نظر مي رسد که مايلوما در مردان شايع تر از زنان مي باشد. به طور کامل علت اين امر مشخص نيست اما مي تواند به دليل اثرات هورموني و شرايط کاري باشد. بيماران مبتلا به مايلوما داراي علايمي نظير کم خوني ، درد استخوان ، شکستگي هاي پاتولوژيک ، خون ريزي ، اختلالات عصبي و ناهنجاري کليه مي باشند. اين عوارض به علت افزايش بار تومور و يا ترشح يک سري از سايتوکاين ها توسط پلاسماسل بدخيم ايجاد مي شوند (١، ٢).
مالتيپل مايلوما به عنوان يک بيماري غيرقابل درمان در نظر گرفته مي شود. اگر بيماران به صورت استاندارد درمان شوند، ميزان بقاي آنها به طور ميانگين ٣ سال و در صورتي که تحت شيمي درماني با دوز بالا يا پيوند قرار بگيرند، ٥ سال مي باشد (٣).
تحقيقات نشان داده است که سلول هاي مايلومايي تعدادي ازفاکتورهاي فعال کننده استئوکلاست (OsteoclastActivating Factors; OAFs)را ترشح مي کنندوازاين طريق باعث افزايش شکل گيري وفعاليت استئوکلاست ها مي شوند (٤، ٥). بعضي از اين فاکتورها شامل لنفوتوکسين ، اينترلوکين ٣ (IL-3 ; 3Interleukin )، اينترلوکين ١ (IL-1 ;١-Interleukin)، (α TNF)α Tumor Necrosis Factor،1α( MIP)Macrophage α١-Inflammatory Protein و (βTGF)Transforming Growth β-Factor مي باشند (٦، ٧) (شکل ١). بررسي ها نشان داده است که واکنش هاي متقابل بين سلول هاي مايلومايي و سلول هاي استرومال نقش بسيار مهمي در ايجاد ضايعات استخواني در مبتلايان به مايلوما دارند. در مطالعات جديد گزارش شده است که سيستم RANKL.RANK نقش مهمي در شکل گيري و فعاليت استئوکلاست ها دارد (٤، ٨، ٩). از طرفي محققين اظهار مي کنند که اختلال در تنظيم سيستم RANK.RANKL مي تواند نقش با اهميتي در پاتوژنز بيماري استخواني مبتلايان به مايلوما داشته باشد (١٠، ١١).
مالتيپل مايلوما و استئوکلاست
شکل ١: تصوير شماتيک مربوط به برخي از فاکتورهايي که در ايجاد درگيري استخواني در مالتيپل مايلوما نقش دارند.
RANK يک پروتئين هموترايمريک است و عضوي ازReceptor Super Family TNF مي باشد. پيش ساز استئوکلاست ، استئوکلاست بالغ ، سلول دندرتيک و غدد پستاني اين پروتئين را بيان مي کنند. از طرفي RANK توسط برخي از سلول هاي توموري مانند سرطان سينه و سرطان پروستات نيز بيان مي شود و در متاستاز اين تومورها به بافت استخوان نقش دارد (١٠، ١١).
مولکول RANKL پروتئين هموترايمريک و عضو جديدي از سوپر فاميلي Family of Ligand TNF مي باشد (١٢-١٠).
ژن RANKL در انسان روي کروموزوم 14q13 واقع گرديده است و شامل ٥ اگزون مي باشد. پروتئين آن از ٣١٧ اسيدآمينه تشکيل شده است . بيان ژن RANKL به صورت Alternative Splicing مي باشد.
RANKL توسط غدد لنفاوي محيطي ، استخوان ، تيموس پلاک هاي پي ير، مغز، قلب ، پوست ، کليه ، عضلات اسلکتي ، ريه و کبد به ميزان زياد بيان مي شود. سلول هاي B و T فعال شده ، استئوبلاست ، استرومال ، سينوويال ، فيبروبلاست ، اندوتليال و کندروسيت اين پروتئين را ترشح مي کنند؛ اين پروتئين داراي نقش هاي متعددي در استئوکلاستوژنزيس مي باشد به شرح زير است :
اتصال و فيوژن پيش سازهاي استئوکلاست ها به يکديگر تشکيل سلول هاي چندهسته اي ،تمايزپيش سازهاي استئوکلاست به استئوکلاست بالغ ، اتصال و چسبيدن استئوکلاست ها به سطوح استخوان ، فعال کردن استئوکلاست ها به منظور شرکت در باز جذب جلوگيري از آپوپتوزيس استئوکلاست ها و حفظ بقاي اين سلول ها مي باشد (١٢).
به دنبال فعال شدن RANK، تکثير و بقاي استئوکلاست ها افزايش مي يابد، از طرفي اتصال استئوکلاست ها به يکديگر و فعال شدن آنها روي مي دهد که در نهايت منجر به افزايش تعداد و افزايش فعاليت اين سلول ها مي شود (١٢). به دنبال فعال شدن RANK اين مولکول از طريق دومن هاي Rich TNFR like Cysteine به دومن Extracellular Receptor Binding مولکول RANKL متصل مي شود. اين واکنش ها منجر به اليگومريزاسيون RANK و متعاقب آن فعال شدن انواع متفاوتي از مسيرهاي انتقال سيگنال مي گردد و در نهايت بسياري از ژن هاي اختصاصي استئوکلاست ها مانند کاتپسين K، گيرنده کلسي تونين ، اينتگرين OSCAR، β3 و TRAP بيان مي شوند (١٢، ١٣) (شکل ٢).
RANK signaling از طريق مسيرهاي انتقال سيگنال متفاوت در تنظيم فعاليت استئوکلاست ها نقش دارد که برخي از آنها عبارت هستند از:
١. مسير انتقال سيگنال κB NF
٢. مسير انتقال سيگنال JNK
٣. مسير انتقال سيگنال PTK AKT
به دنبال اتصال RANKL به RANK مولکول ٦ TRAF به عنوان آداپتور به نواحي خاصي از دومن داخل سلولي RANK متصل مي شود.
در واقع دومن داخل سلولي مولکول RANK فاقد فعاليت آنزيماتيک بوده که جهت ادامه انتقال سيگنال از TNF Receptor Aso TRAF ٦-siated Factor) کمک به نقش سيستم RANKL در شکل گيري استئوکلاست نرمال به طور مختصر اشاره شد. طبق گزارش ، تنظيم غيرطبيعي اين سيستم مي تواند باعث اختلالاتي از جمله ليز شدن استخوان باشد که مي توان به بيماري ها مالتيپل مايلوما اشاره کرد (٨، ٩، ١٤).
شکل ٢: تصوير شماتيک مربوط به مسير انتقال سيگنال RANK در سلول استئوکلاست
فرض بر اين است که حضور سلول هاي مايلومايي در ريزمحيط مغز استخوان اين بيماران باعث تغيير در ميزان بيان RANK،RANKL و OPG شودکه در نهايت باعث عدم توازن در بيان اين مولکول ها شده است . در نتيجه بيان RANKL افزايش يافته و باعث افزايش شکل گيري استئوکلاست ها و متعاقب آن افزايش جذب استخوان يا همان تخريب استخوان مي گردد (١٥). احتمال داده مي شود که عدم توازن در بيان اين مولکول ها و به خصوص RANKL از طريق اين مسيرهايي که در ذيل به آنها اشاره شده است ايجاد شود:
١.ممکن است سلول هاي مايلومايي موجوددرمغزاستخوان باعث افزايش بيان RANKL توسط برخي از سلول هاي موجود در ريز محيط مغز استخوان شده وبه صورت غيرمستقيم باعث افزايش شکل گيري وفعاليت استئوکلاست ها و به دنبال آن افزايش جذب يا تخريب استخوان شود (١٦،١٥).
٢. احتمال ديگري وجود دارد که سلول هاي مايلومايي ، خود، به صورت مستقيم RANKL را بيان کنند و از اين طريق باعث شکل گيري استئوکلاست ها و جذب استخوان شوند (١٥، ١٧).
نظريه سوم بر اين است که سلول هاي مايلومايي مي توانند از طريق مهار توليد OPG (که به عنوان Decoy Receptor براي RANKL مي باشد) نقش خود را ايفا کنند، در اين صورت RANKL به جاي اتصال به OPG به مولکول RANK اتصال مي يابد و از اين طريق باعث افزايش فعاليت و افزايش شکل گيري استئوکلاست ها مي شود (٢١-١٨).
مواد و روش ها
مطالعه حاضر بر اساس مجوز کميته اخلاق پزشکي دانشگاه تربيت مدرس ، دانشکده علوم پزشکي انجام شد و فرم مربوط به رضايت نامه از تمامي بيماران اخذ گرديد.
تمامي نمونه ها مربوط به بيماران مشکوک به مالتيپل مايلوما و لوسمي پلاسماسل بودند، بنابراين جهت تاييد از نظر وجود سلول هاي مايلومايي نتايج به مربوط آناليز فلوسايتومتري ، گزارش هاي پاتولوژي بيوپسي و مغز استخوان و بررسي لام خون محيطي و يا آسپيره تمامي بيماران به همراه گزارش مربوط به پرونده هاي پزشکي اين بيماران بررسي شدند.
جداسازي RNA از نمونه هاي مغز استخوان و خون محيطي بيماران و رده هاي سلولي ٩٣٧-U،RPMI ، ٢٦٦-U و Hela با استفاده از روش Guanidine thiocynate صورت گرفت . براي اطمينان از کيفيت RNA استخراج شده مراحل کنترل کيفي شامل تعيين غلظت RNA و خلوص آن (OD260.280) با بيوفتومترEppendorfٍ انجام شد. سنتز cDNA با استفاده از آنزيم MULV M صورت گرفت . براي اطمينان از کيفيت cDNA ساخته شده ، واکنش زنجيره پليمراز به منظور شناسايي يک ژن که بيان هميشگي دارد (House Keeping Gene) انجام شد. براي اين منظور پرايمرهاي ژن βμ جهت ارزيابي بيان اين ژن و کنترل ساخت cDNA استفاده گرديد.
جهت بررسي بيان mRNA مربوط به ژن هاي RANKL و RANK در سلول هاي مايلومايي بيماران و رده هاي سلولي مورد نظر، پرايمرهاي مربوط به اين دو ژن طراحي شدند؛ طراحي پرايمرهاي مورد نياز با استفاده از نرم افزارهاي OLIGO و GENERUNNER انجام شد NCBI Blast، تاييد شدند (جدول ١ و ٢).
در اين مطالعه جهت بررسي و مشاهده محصول PCR علاوه بر ژل پلي اکريل آميد از ژل آگارز ١.٥ درصد نيز استفاده شد.
يافته ها
در اين مطالعه با استفاده از تکنيک PCR RT توانستيم نشان بدهيم که 266 U (رده سلول مايلومايي ) و پلاسماسل هاي جدا شده از بيماران مبتلا به مايلوما، RANK و RANKL رادر سطح mRNA بيان مي کنند (جدول ٣ و ٤).
بحث
مالتيپل مايلوما بدخيمي مربوط به پلاسماسل ها مي باشد (١، ٢).
تخريب هاي پيش رونده استخواني يکي از مهم ترين ويژگي هاي اين بيماري است .
تخريب استخواني توسط فاکتورهاي فعال کننده استئوکلاست (OAF) ايجاد مي شود (٣).
اين فاکتورها يا به صورت موضعي توسط پلاسماسل هاي مونوکلونال و يا توسط سلول هاي استرومال مغز استخوان توليد مي شوند که باعث تحريک تمايز، شکل گيري ، بقا و در نهايت افزايش فعاليت استوکلاست ها و متعاقب آن افزايش تخريب استخوان و
