بخشی از مقاله
چکیده
یک ژن رمز آننده آنتیپ ورتر Na+/H+ واآئ ولی، ZomNHX1، از گی اه هالوفی ت Zostera marina L. ج دا گردی د و ب ا اس تفاده از برنام هه اي آامپیوتري مورد بررسی و آنالیز قرار گرفت. جداسازي آام ل ای ن ژن ب ا اس تفاده از تکنی ک پ یس یآر واران ه ص ورت گرف ت. ای ن ژن ح دودا ٧/٢ آیل و جفت باز میباشد آه حاوي یک ناحیه رمز آنن ده ١٦١٧ جف ت ب ازي اس ت. ی ک پ روتئین ٥٣٨ اس ید آمین هاي توس ط ای ن ژن رم ز م یش ود آ ه احتم الا ی ک آنتیپورتر Na+/H+ واآئولی است آه در مکانیسم تحمل تنش شوري نقش دارد. با مقایسه توالی اسیدآمین ه ZomNHX1 ب ا س ایر آنت یپورتره اي گی اهی مشخص گردید آه بسیار شبیه آنتیپورترهاي غ لات م یباش د. ژن ZomNHX1 داراي ١١ اینت رون م یباش د. در ناحی ه ب الا دس ت ای ن ژن در موقعی ت ٥٢-، یک uORF شش اسدآمینهاي وجود دارد آه چنین ناحیهاي در سایر ژنهاي جداشده از این گیاه نیز دیده شده است.
کلمه های کلیدی: ZomNHX1، eelgrass - Zostera marina L. - ، آنتیپورتر Na+/H+ و شوري.
مقدمه
تنش شوري یکی از مشکلات عمده آشاورزي بویژه در مناطق خشک و نیمه خشک م یباش د. اث رات منف ی ناش ی از ای ن تنش مانع رسیدن گیاهان به حداآثر پتانسیل عملکرد میگردد. عمده اثرات ناشی از ش وري در گیاه ان ب دلیل اف زایش غلظ ت یونهاي سمی در گیاه و ایجاد عدم تعادل یونی همرا با تنش آم آبی در گیاه است - بلوموالد و همکاران، ٢٠٠٠ - . سدیم یکی از یونهایی اس ت آ ه ب ا اف زایش غلظ ت آن درسیتوپلاس م گیاه ان تح ت ت نش ش وري موج ب اخ تلال در فرآین دهاي بیوش یمیائی و فیزیولوژیکی گیاه میشود. در حقیقت افزایش یون سدیم سبب اخ تلال در ج ذب و عم ل ی ون پتاس یم و آ اهش نس ب K+/Na+ میشود آه این موضوع اآثر فرآیندهاي فیزیولوژیک گیاه را تحت تاثیر قرار میدهد - خان و عبداله، ٢٠٠٣ - . بنابراین جهت تحمل تنش شوري، براي گیاه ضروري است آه بتواند غلظت یون سدیم را در سیتوپلاسم پائین نگه دارد.
در گیاهان، یون سدیم به واسطه فعالیت آنتیپورترهاي Na+/H+ از سیتوزول به بیرون رانده م یش ود . آنت یپورتره اي واآئولی با فرستادن یونهاي سدیم به درون واآئول گیاه آن را از سیتوزول دور میآنند. تح ت ش رایط ت نش ش وري، بی ان ژن رمز آننده آنتیپورترهاي واآئولی افزایش مییابد آه نشان از اهمیت این پروتئین در مکانیسمهاي تحمل تنش دارد - فوآ ودا و همکاران، ١٩٩٩ - . با تحقیقات انجام شده در گیاهان مشخص گردیده آه آنتیپورترهاي واآوئلی توسط یک خ انواده چن د ژن ی رمز میشوند براي مثال در ذرت و آریبدوپسیس ب راي آن ش ش ایزوف رم وج ود دارد. ب ا تحقیق ات ص ورت گرفت ه در مخم ر نشان داده شده است آه همانند گیاهان در مخمر نیز آنتیپ ورتر واآئ ولی نق ش بس زائی در تحم ل ت نش ش وري دارد. همچن ین طی تحقیاتی مشخص گردی ده آ ه س مزدائ ی س دیم در مخم ر از طری ق انتق ال ب ه درون واآئ ول بس یار ش بیه گیاه ان اس ت. ب ا انتقال ژن رمز آننده آنتیپورتر گیاهی به درون مخمرهاي جهش یافته فاقد ای ن ژن آ ه حس اس ب ه ش وري بودن د مش اهده ش ده است آه پروتئینهاي گیاهی به خوبی توانستهاند جاي پروتئینهاي مخمري را پر آرده و مخمر را به شوري متحم ل آنن د آ ه این امر دلالت بر تشابه عمل آنتیپورترهاي گیاهی و مخمري دارد - یوآوي و همکاران، ٢٠٠٢ - .
همانگونه آه ذآر گردید گزارشهاي متعددي دال بر اهمیت آنتیپورترهاي واآئولی در تحمل تنش شوري وجود دارد آه در این میان ژنهاي رمز آننده این پروتئین در گیاهان هالوفیت جایگ اه وی ژهاي دارن د. هالوفیته ا ب ا پ ائین نگ ه داش تن غلظ ت یونهاي سمی از جمله سدیم در سیتوزول تحت ش رایط ت نش ای ن امک ان را ب راي خ ود ف راهم م یآورن د آ ه بتوانن د ت نش را ب ه خوبی پشت سر بگذارد. بنابراین ژنهاي رمز آننده آنتیپورترهاي واآوئولی در گیاهان هالوفیت میتوانند نامزدهاي مناس بی براي اصلاح گیاهان زراعی مه م و حس اس نس بت ب ه ت نش ش وري باش ند. ب ا اس تفاده از ای ن ژنه ا از طری ق مهندس ی ژنتی ک میتوان گیاهان زراعی متحمل نسبت به تنش شوري ایجاد نمود. علاوه بر ای ن م یت وان ب ا بررس ی و تجزی ه و تحلی ل ت والی نوآلئوتیدي این ژنها و توالی اسیدآمینهاي پروتنئینهاي رمز شونده توسط آنها و مقایسه آنها با گیاهان معمولی به درك بیشتري نسبت به توانائیهاي این آنتیپورترها در مکانیسمهاي تحمل دست یافت.
گیاه eelgrass با نام علمی Zostera marina ی ک گی اه ت ک لپ هاي دری ائی اس ت آ ه ق ادر اس ت در ش وري ٣ -٥% آب دریا به خوبی رشد نموده و چرخه رشد خود را آام ل آن د - ی و و زاو، ٢٠٠٣ - . ت ا آن ون مطالع ات زی ادي ب ر روي ای ن گی اه صورت گرفته است اما درك ما از مکانیس مهاي تحم ل موج ود در آن بس یار ن اچیز اس ت . ب ر اس اس بررس یه اي انج ام ش ده مشخص شده است آه این گی اه ج د مش ترك ب ا ب رنج داش ته و ب ه هم ین دلی ل م ی توان د ب ه عن وان ی ک منب ع ژن ی مناس ب جه ت اصلاح برنج براي شرایط تنش ش وري م ورد اس تفاده ق رار گی رد. ب ه هم ین دلی ل ط ی تحقیق اتی آ ه در دانش گاه هیروش یماي ژاپن صورت گرفته است سعی بر جداسازي ژنهاي رمز آننده پروتئینهاي مهم در مکانیسمهاي تحمل نسبت ب ه ت نش ش وري از ای ن گی اه گردی ده اس ت. یک ی از ژنه اي ج دا ش ده، ی ک ژن رم ز آنن ده آنت یپ ورتر Na+/H+ واآئ ولی م یباش د آ ه ZomNHX1 نامیده شده است. با تجزیه و تحلیل توالی این ژن و توالی اسیدآمینههاي پ روتئین رم ز ش ونده توس ط آن رابط ه فیلوژنتیکی آن با سایر آنتیپورترها جدا شده از سایر گیاهان مورد بررسی قرار گرفته است.
مواد و روش ها جمع آوري نمونه هاي گیاهی
برگه اي گی اه Z. marina از منطق ه یاس ورا واق ع در اس تان هیروش یما، ژاپ ن جم عآوري گردی د و بلافاص له ب ا آب ش یر شسته شدند و پس از منجمد آردن در ازت مایع در دماي ° C٨٠- نگهداري شدند. طراحی پرایمر و واآنش زنجیره اي پلیمراز DNA ژنومی به روش CTAB از برگها جدا گردیده و با استفاده از فنل خالص شدند. از سوي دیگر بر اس اس ن واحی حفظ شده توالی آنتیپورترهاي واآئولی در سایر گیاهان آغازگرهاي مناسبی طراحی گردی د. ب ا اس تفاده از ای ن آغازگره ا ی ک قطعه ١٣٢٠ جفت بازي از ژنوم گیاه جدا گردی د آ ه ان دازه آن ب ا ان دازه م ورد انتظ ار همخ وانی داش ت. ب ا ت والی ی ابی قطع ه مذآور مشخص گردید آه این قطعه مربوط به یک آنتیپورتر واآئولی میباشد. با توجه به ت والی ای ن قطع ه ی ک جف ت آغ ازگر اختصاصی طراحی گردید و با استفاده از تکنیک پیسیآر وارانه نواحی ′٣ و ′٥ ژن تکثیر و توالییابی گردید.
استخراج RNA و تهیه cDNA
با استفاده از روش لیتیم آلرید تغییر یافته - ع المزاده و همک اران، ٢٠٠٥ - RNA از برگه اي گی اه م ذآور جداس ازي و ب ا استفاده از فنل خالص گردید. با استفاده از آیت ReverTra Ace، از روي RNA اس تخراج ش ده cDNA تهی ه آردی د. ب ر اساس توالی ژن، یک جفت آغازگر اختصاصی براي ناحیه بالادست و پ ائین دس ت ژن طراح ی گردی د. ب ا آغازگره اي م ذآور ناحیه رمزآننده ژن از cDNAs تکثیر گردید و توالییابی گردید. ناحیه رمز آننده ژن به درون ناقل مناسب الحاق و سپس به درون ب اآتري Escherichia coli س ویه JM109 منتقل گردی د. ب ا اس تفاده از آغازگرهاي م ذآور توالی ژن از ژن وم نی ز جداسازي و توالییابی گردید.
نتایج و بحث
ناحیه رمز آننده یک ژن احتمالی براي آنتیپورتر Na+/H+ واآئولی با موفقیت از ژنوم و cDNAs تهیه ش ده از RNA اس تخراج ش ده از ب رگ گی اه Z. mariana جداش ده و ت والیی ابی گردی د - ش کل ١ - . ناحی ه رم ز آنن ده ژن ١٦١٧ جف ت ب ازشکل.1 توالی ژن .ZomNHX1 نواحی رمز آننده یک خط زیرشان آشیده شده است. ناحیه بالا دست ژن دو خط زیرشان آش یده ش ده اس ت. uORF به صورت پررنگ نشان داده شده است. می باشد آه یک پروتئین ٥٣٨ اسید آمینهاي را رمز میآند. با مقایس ه ت والی ناحی ه رم ز آنن ده ب ا آ ل ژن مش خص گردی د آ ه این ژن حاوي ١٢ اگزون و ١١ اینترون میباشد. ع لاوه ب ر ای ن، ٨٢ جف ت ب از ب الا دس ت متی ونین ش روع آنن ده نی ز ت والی ی ابی گردی د آ ه در موقعی ت ٥٢- ح اوي ی ک upstream open reading frame - uORF - ش ش اس ید آمین هاي - MPTVSG - میباشد - شکل ١ - . نواحی uORF دیگري نیز در ناحیه بالا دست سایر ژنهاي این گیاه مش اهده ش ده اس ت.
- فوآوهارا و همکاران، ١٩٩٦ ؛ عالمزاده و همکاران، ٢٠٠٦ - . طی تحقیق ات انج ام ش ده پیش نهاد ش ده اس ت آه به احتمال زیاد این نواحی در تنظیم بیان ژن پائین دست خود نقش دارند - آرانگو و همکاران، ٢٠٠٣ - . با استفاده از برنامه ClustalW توالی اس یدآمینهاي آنت یپورتره اي Na+ /H+ واآئ ولی در گیاه ان همردی ف ش دند و ب ر اس اس آن ب ا اس تفاده از برنام ه phylodraw نم ودار فیلوژنتی ک رس م گردی د. ب ر اس اس ای ن نم ودار مش خص گردی د ک ه ZomNHX1 همراه با آنتیپورترهاي غلات در یک گروه قرار می گیرد - شکل٢ - . با توجه به تشابه پروتئینه ای ای ن گی اه با غلات و اشاره به این موضوع که این گیاه یک گی اه هالوفی ت اس ت، م ی ت وان انتظ ار داش ت ک ه در آین ده ب ا انتق ال ژنه ای رمز کننده این پروتئینها به غلات مهم به ویژه برنج قدمهای مهمی در راه اصلاح گیاهان متحمل به شوری برداشت.
