بخشی از مقاله
چکیده
در دهههاي اخیر توسعهي تکنولوژيهاي مبتنی بر DNA و سیستمهاي بیان پروتئین نوترکیب بطور وسیعی براي تولید انواع مختلف پروتئینهاي نوترکیب دارویی بکار رفته است. اخیرا، بدلیل پتانسیل هزینهي پایین، تولید پروتئینهاي نوترکیب با کیفیت بالا و مقیاسپذیري بالا کاربرد گیاهان بعنوان یک سیستم تولید توجه زیادي را به خود جلب کرده است. یکی از پروتئینهاي نوترکیب مهم Lآسپارژیناز - ASN - II است که تحت نام تجارتی Elspar براي درمان لوسمی لنفوبلاستیک حاد - ALL - در Escherichia coli نوترکیب تولید میشود. ما در این تحقیق ساخت یک ناقل دوتایی حاوي نسخهي بهینهسازي شده براي بیان گیاه از ژن Asn رمز کنندهASN را شرح میدهیم.
به این منظور، براساس توالی AsnB در NCBI، ژنAsnB بهینهسازي شده براي توتون بطور مصنوعی ساخته شد و در پاییندست راهانداز تقویت شده CaMV 35S ناقل دوتایی pBI121 کلون گردید. یک توالی برچسب هیستیدین و یک توالی رمز کننده پپتید نشانه نگهداري در شبکهي اندوپلاسمی - KDEL - نیز به انتهاي 3' متصل شده است. دستواره حاصل - با نام - pBI121-NtAsn به E. coli انتقال یافت و درستی ساختار آن توسط آنالیزهاي برش آنزیمی و PCR تأیید شد. دستواره نوترکیب میتواند براي بیان و تولید ASN در یک پلت فرم گیاهی در تحقیقات بعدي مورد استفاده قرار گیرد.
مقدمه
لوسمی لنفوسیتی حاد یا لوسمی لنفوبلاستیک حاد 1 - ALL - ، نوعی از سرطان است که از سلولهاي اولیهي سفید خون در مغز استخوان که لنفوسیت2 خوانده میشوند، آغاز میشود. در این بیماري سلولهاي لوسمی به سرعت در خون پیشروي کرده و سپس به سایر قسمتهاي بدن از جمله غدد لنفاوي، کبد، طحال، سیستم عصبی مرکزي - مغز و نخاع - و بیضهها - در مردان - انتشار مییابد. سالانه 6000 مورد جدید 3400 - مرد و 2600 زن - بیماري لوسمی لنفوبلاستیک حاد در ایالات متحده امریکا تشخیص داده میشود . - 8 - آنزیم -Lآسپارژیناز هیدرولیز اسیدامینهي -Lآسپارژین به -Lآسپارتات و آمونیوم را کاتالیز میکند.
مطالعات نشان دادهاست که این آنزیم با هیدرولیز -Lآسپارژین که براي سلولهاي توموري ضروري است نقش عمدهاي را در درمان این بیماري ایفا میکند . - 2 - پیشرفتهاي اخیر در مهندسی ژنتیک گیاهی بیان موفق پروتئینهاي نوترکیب درمانی با ارزش را در گیاهان امکانپذیر ساخته است. از مهمترین مزایاي گیاهان به عنوان راکتورهاي زیستی براي تولید پروتئین نوترکیب میتوان به هزینههاي پایین تولید، افزایش مقیاس سریع و کارآمد، تولید فرآوردههاي بیولوژیکی فعال و مشابه شکل طبیعی، پایداري بیشتر و همچنین عدم وجود بیماريهاي مشترك انسان و دام و همچنین خطرات ناشی از آلودگی با عوامل بیماریزاي انسانی اشاره کرد .
- 6 - راهکارهاي بکار رفته براي بهبود عملکرد پروتئین نوترکیب شامل افزایش بیان ژن منتقل شده با توسعه راهاندازهاي جدید، بهبود پایداري و تجمع1 پروتئین از طریق استفاده از پپتیدهاي علامتی2 که پروتئین را به داخل اجزاء درون سلولی هدفگیري میکنند و بهبود تکنولوژيهاي پردازش پایین دست میباشد . - 4 - بیان پروتئین نوترکیب در بافت مناسب و همچنین افزایش پایداري و تجمع پروتئین با استفاده از عوامل هدفگیري به جایگاههاي مناسب در سلول، از مهمترین عوامل موثر بر افزایش میزان تولید پروتئینهاي نوترکیب در گیاهان است.
پایداري و تجمع پروتئین نوترکیب میتواند با هدفگیري و نگهداري آن در اجزاء سلولی مسیرهاي ترشحی، مانند شبکه اندوپلاسمی - ER - که فعالیت هیدرولیتیک کمتري دارد افزایش یابد . - 3 - پروتئینها میتوانند با استفاده از پپتیدهاي علامتی انتهاي آمینی3 به درون شبکه اندوپلاسمی هدفگیري شوند. همچنین نواحی ترجمه نشده 5´ و5' UTR - 3´ و - 3' UTR با تاثیر بر پایداري mRNA، موضعیابی و کارایی ترجمه نقش بسیار مهمی در تنظیم بیان ژن در سطح پس از رونویسی ایفا میکنند.
- 5 - در این تحقیق ژن AsnB رمز کنندهي آنزیم -Lآسپاراژیناز II از منشا باکتري Escherichia coli، براي ساخت دستوارهي بیانی گیاهی تحت راهانداز 35S 2xe و توالی پایاندهنده NOS حاوي یک ناحیه ترجمه نشده ساختگی، توالی نشانه KDEL براي هدفگیري پروتئین نوترکیب به درون شبکه آندوپلاسمی و توالی برچسب پلی هیستیدینی His-tag استفاده شد. از این دستواره میتوان به منظور انتقال این ژن به سیستم گیاهی براي تولید آنزیم نوترکیب دارویی استفاده کرد.
مواد و روشها
پلاسمیدها و باکتريها ش
در این تحقیق از پلاسمیدهاي pUC57-Asn حاوي ژن رمزکننده آنزیم -Lآسپاراژیناز - AsnB - II با توالی بهینه شده گیاهی - بر اساس کدونهاي ترجیحی توتون - ، pCHMS، pBI121 و باکتري E. coli سویهي DH5α جهت همسانهسازي و تهیه دستواره استفاده شد. توالی ژن بر اساس محاسبه شاخص سازگاري کدون - 4CAI - و با استفاده از کدونهاي ترجیحی توتون با در نظر گرفتن سایر موارد - محتوي A+T و G+C، ساختار ثانویه و پایداري mRNA و توالیهاي مورد توافق اطراف کدون آغازین - بهینهسازي شد و پس از سنتز در پلاسمید pUC57 همسانه شد.
تهیه دستواره نوترکیب
به منظور ساخت دستواره مولکولی حاوي ژن AsnB، پلاسمید pUC57-Asn توسط آنزیمهاي XhoI و SstI برش داده شد تا قطعهاي به طول 1099 bp بدست آید. سپس قطعه مذکور طی واکنش اتصال آنزیمی به وسیله آنزیم T4 DNA Ligase به جایگاه SstI/XhoI در پلاسمید pCHMS متصل شد و بدین ترتیب دستواره جدید pCHMS-Asn ساخته شد. پس از تایید دستواره نوترکیب با استفاده از برشهاي آنزیمی، پلاسمید مذکور با آنزیمهاي برشی HindIII و SstI برش داده شد و قطعه حاصل به تقریبی طول 1800 bp - شامل راهاندازه 35S 2xe و توالی رمز کننده آنزیم -Lآسپاراژیناز - II در ناقل pBI121، خطی شده با آنزیمهاي برشی HindIII و SstI، طی فرآیند اتصال با استفاده از آنزیم T4 DNA ligase درج گردید.
بدین ترتیب دستواره نوترکیب pBI121-Asn تحت راهانداز 35S 2xe و توالی پایاندهنده NOS ساخته شد - شکل . - 2 محصول واکنش اتصال به روش ذوب و انجماد - 7 - به باکتري E. coli سویهي DH5α انتقال داده شد. جهت انتخاب کلونیهاي حاوي پلاسمید نوترکیب از آنتیبیوتیک کانامایسین - 50 µg/ml - در محیط کشت استفاده گردید. استخراج پلاسمید از کلونیهاي نوترکیب به روش - 1 - mini-prep انجام گردید و سپس درستی ساختار آن به وسیله برشهاي آنزیمی مناسب و آنالیز PCR تأیید شد.
نتایج و بحث
تایید دستواره نوترکیب توسط آنالیز برش آنزیمی
پلاسمید نوترکیب از باکتريهاي نوترکیب رشد یافته در محیط کشت گزینش استخراج شد و به وسیله برشهاي آنزیمی مناسب به شرح زیر مورد تایید قرار گرفت.
تایید دستواره نوترکیب
در آنالیز برش آنزیمی براي تایید ساختار دستواره نوترکیب pCHMS-NtAsn، برش توسط آنزیم XhoI باعث خطی شدن پلاسمیدهاي pCHMS و pCHMS-Asn شده که وزن مولکولی بیشتر پلاسمید نوترکیب نشان دهنده وارد شدن قطعه الحاقی در ساختار دستواره نوترکیب است. در اثر برش با آنزیمهاي XhoI و SstI نوار 1099 bp - قطعه الحاقی - براي پلاسمید نوترکیب حاصل شد و به این ترتیب حضور تراژن در پلاسمید نوترکیب تایید شد - شکل . - 1A
تایید دستواره نوترکیب NtAsnزکذکقنp
حضور ژن Asn در پلاسمید pBI121-NtAsn به وسیله برشهاي آنزیمی مناسب تایید شد - شکل . - 1B برش پلاسمیدهاي نوترکیب و pBI121 توسط آنزیم HindIII باعث خطی شدن هر دو پلاسمید شد، با این تفاوت که در برش پلاسمید نوترکیب به دلیل وارد شدن قطعه الحاقی با اندازهاي کوچکتر از قطعه خارج شده توسط برش با آنزیمهاي برشی HindIII و SstI از پلاسمید pBI121 نواري با وزن مولکولی کمتر مشاهده شد.
در برش توسط آنزیم BamHI به دلیل وجود یک جایگاه برش در قطعه الحاقی و حذف جایگاه برش موجود بر روي پلاسمید به دلیل ورود قطعه مورد نظر پلاسمید به صورت خطی در آمد، که اندازه مولکولی کوچکتر آن نسبت به پلاسمید خطی شده pBI121 توسط آنزیم BamHI نشانگر درج قطعه الحاقی میباشد،. برش پلاسمید نوترکیب با آنزیمهاي SstI و HindIII باعث ایجاد قطعهاي با اندازه تقریبی 1800bp و هم اندازه قطعه الحاقی شد. برش توسط آنزیمهاي EcoRI و HindIII باعث ایجاد دو قطعه با اندازههاي تقریبی 750 و 1300 جفت باز در پلاسمید نوترکیب شده است که به دلیل وجود جایگاه برش براي آنزیم EcoRI در قطعه الحاقی است. نتایج حاصل از برش آنزیمی صحت دستواره ساخته شده pBI121-NtAsn را تایید نمود.
