بخشی از مقاله
چکیده
آنزیم NADP-Malic یک آنزیم کلیدي در برخی از فرآیندهاي زیستی مهم گیاهان همچون تولید ATP ، تولید فلاونوئیدها، تنظیم pH و پاسخ به تنشهاي غیر زنده از جمله شوري و خشکی است. دو فرم غیرفتوسنتزي این آنزیم در سیتوپلاسم و کلروپلاست گیاهان سه کربنه همچون خانواده گندمیان شناسایی شده اند. این مطالعه به منظور جداسازي،همسانه سازي، توالییابی و بررسی خصوصیات مولکولی قسمتی از ژن رمزکنندهي آنزیم NADP-Malic در گندم دوروم انجام شد. با استفاده از آغازگرهاي طراحی شده از ژن رمزکننده آنزیم NADP-Malic در گندم نان - Triticum aestivum - ، یک قطعه از cDNA این ژن در گندم دوروم - Triticum durum - رقم یاواروس جداسازي شد. پس از همسانهسازي، قطعهاي به طول 717 bp توالییابی شد. توالی بدست آمده با توالی ژن رمزکننده آنزیم NADP-Malic در گندمنان کاملا یکسان بود. دو ناحیه عملکردي مرتبط با آنزیم مالیک در توالی اسیدآمینهاي قطعه توالی یابی شده شناسایی شدند.
کلمات کلیدي: ژن رمزکننده آنزیم NADP-Malic ، گندم دوروم
مقدمه
آنزیم 1 NADP-Malic کاتالیزور واکنش اکسیداتیو دکربوکسیلاسیون2 مالات است که باعث تولید پیروات، CO2 و NADPH در حضور یک کاتیون دیوالانت مانند منگنز یا منیزیم میشود - . - 2این آنزیم در برخی از فرآیندهاي زیستی مهم گیاهان همچون تولید ATP ، تولید فلاونوئیدها، بیوسنتر لیپیدها، تنظیم pH و پاسخ به تنشهاي غیر زنده از جمله شوري و خشکی فعالیت میکند - 2،. - 5 دیرینکویچ3 و همکاران - - 2001 هفت آیزوفرم این آنزیم را بر اساس نقش و محل فعالیتشان گروهبندي کردند. سه آیزوفرم این آنزیم در گیاهان C4 شامل C4 - 1 - -NADP-ME فرمی فتوسنتزي در کلروپلاست غلاف آوندي؛ C4 - 2 - -NADP-ME با فعالیت غیرفتوسنتزي در پلاستید و C4 - 3 - -NADP-ME ، فرم غیرفتوسنتزي در سیتوپلاسم می باشند.دو آیزوفرم این آنزیم در گیاهان CAM به نامهاي CAM - 1 - -NADP-ME وCAM - 2 - -NADP-ME که اولی فرمی سیتوپلاسمی و فتوسنتزي و دومی آیزوفرم غیرفتوسنتزي است. دو آیزوفرم دیگر این آنزیم با فعالیت غیر فتوسنتزي در گیاهان سه کربنه به شکل سیتوپلاسمی C3 - 1 - -NADP-ME و کلروپلاستیC3 - 2 - -NADP-ME یافت میشوند.
کاساتی4 و همکاران - - 1999 وجود فرم پلاستیدي این آنزیم در گندم نان را گزارش کردند. بررسی بیان ژن NADP-ME در گندم هگزاپلوئید نشاندهنده تاثیرپذیري این ژن از تغییرات محیطی بود - . - 4 حتی انتقال ژن NADP-ME از برنج تحمل تنش اسمزي و شوري را در آرابیدوپسیس افزایش داد - 2،. - 5 در برخی موارد نیز مشاهده شده است که گیاهان CAM اختیاري که تحت تنش شوري قادر به تغییر متابولیسم سهکربنهي خود به چهارکربنه هستند همزمان با تغییر نوع متابولیسم در آنها، بیان و فعالیت این آنزیم 4 تا 10 برابر شده است - - 6 که نشاندهندهي نقش مهم و کلیدي این آنزیم در تحمل شوري در گیاهان CAM و به خصوص فرمهاي CAاختیاري این گیاهان است. این مطالعه به منظور جداسازي، توالییابی و بررسی خصوصیات مولکولی قسمتی از ژن رمزکنندهي آنزیم NADP-Malic در گندم دوروم انجام شد.
مواد و روشها
براي جداسازي و بررسیهاي مولکولی قطعهاي از ژن رمزکننده NADP-ME در گندم دوروم، رقم تجاري یاواروس در شرایط گلخانه کشت شد. براي اجتناب از آلودگی، خاك قبل از استفاده توسط دستگاه استریل کننده، ضدعفونی شد و از برگهايسالم نمونهگیري شد.
طراحی آغازگر: ابتدا با استفاده از توالی ژن در گندم نان - Triticum aestivum L. - به شمارهي دسترسیGeneID: 100137005 - EU082065 - موجود در بانک اطلاعاتی 1NCBI - رمزکنندهي فرم سیتوپلاسمی نوع II گندم نان - ، آغازگرهاي مناسب به منظور جداسازي ژن NADP-ME در گندم دوروم طراحی شدند. فاصله دو آغازگر طراحی شده کمی بیشتر از هفتصد جفت نوکلئوتید بود.
سنتز cDNA و واکنش زنجیرهاي پلیمراز:2 استخراج RNA به روش RNXTM-plus - شرکت سیناژن - ، حذف آلودگیهاي احتمالی DNA به وسیلهي DNase1, RNase free Kit و سنتز cDNA با استفاده کیت شرکت Fermentas انجام شد. پیش از همسانهسازي3 با استفاده از 1/5 میکرولیتر cDNA بهعنوان نمونه تکثیر شونده، واکنش زنجیرهاي پلیمراز انجام شد. برنامه مورد استفاده براي PCR در 35 چرخه تعیین شد که شامل مراحل مندرج در جدول1 بود.
همسانهسازي: مراحل همسانهسازي شامل اتصال4 ، ترانسفورماسیون5، استخراج پلاسمید و آزمون هضم6 با همسانه سازي قطعه DNA جداسازي شده در پلاسمید pTZ57R و استفاده از باکتري E. coli سویهي DH5 انجام شد. پس از همسانهسازي واستخراج پلاسمید و اطمینان از جواب آزمون هضم، قطعه ژن مورد نظر براي با استفاده از پرایمرهاي همگانی M13
Forward و M13Reverse توالییابی شد.
تعیین خصوصیات مولکولی: توالی به دست آمده با استفاده از سرویسهاي بیوانفورماتیک مورد ارزیابی قرار گرفت. توسط جستجوگر بلاست 8 در بانک اطلاعاتی NCBI از روند صحیح جداسازي قطعه توالی یابی شده ژن NADP-ME اطمینان حاصل شد. بهعلاوه با استفاده از سایت سرویسدهندهي پروتئین 9 EXPASY، توالی اسید آمینه هاي قطعه جداسازي شده بهدست آورده شد.با استفاده سرویس آنلاین 2ClustalW مقدار شباهت قطعه توالی یابی شده بین گونه هاي گندم نان و گندم دوروم تعیین و در نهایت ناحیه هاي عملکردي توالی پروتئینی قطعه جداسازي با استفاده از سایت 2 Pfam مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج و بحث
جداسازي ژن: محصول واکنش زنجیره اي پلیمراز یک قطعه به طول تقریبی 700 bp بود که با فاصله آغازگرها در ژنNADP-ME در گندم نان همخوانی داشت.پس از انجام مراحل همسانهسازي و طی آزمون هضم، باند مورد نظر در بین برخی از کلونهاي انتخاب شده، آزاد گردید - شکل - 1 و سپس توالی قطعه اي به طول 717 bp بدست آمد.طبق همردیفی در بانک اطلاعاتی NCBIبا استفاده از سرویس بلاست ضمن تایید صحت جداسازي و همسانه سازي نشان داد که توالی جداسازي شده از رقم یاواروس با توالی ژن NADP-dependent malic enzyme در گندمنان به شماره EU082065.1 صد در صد مشابه است - شکل. - 2 نتیجه حاصل حفظ شدگی کامل ژن مذکور طی تکامل گندم تتراپلوئید و هگزاپلوئید را نشان داد.
توالی پروتئینی ترجمه شده از قطعه جداسازي شده با استفاده از سرویس EXPASY به شرح زیر به دست آمد که طبق آنالیز بهصفکردن3 با استفاده از سرویس ClustalW همسانی صد درصد بین توالی فوق با پروتئین ژن NADP-ME در گندم نان به شماره EU082065 بهدست آمد.بررسی خصوصیات مولکولی :NADP-ME با استفاده از سرویس آنلاین Pfam دو ناحیه4 کارکردي در توالی جداسازي شده مشخص شد. ناحیه اول که شامل 95 اسیدآمینه ابتدایی متعلق به خانوادهي Malic و مربوط به قسمت انتهاي آمینی آنزیم مالیک بود و ناحیه دوم که از اسیدآمینه 105 تا آخرین اسیدآمینه - 239 - و مربوط به جایگاه اتصال NAD - P - و به خانوادهي Mlic_M تعلق داشت.
نتایج قبلی نشاندهنده اهمیت شرایط قلیایی و pH محیط در فعالیت این آنزیم است - . - 1 با افزایش شوري و زیاد شدن کاتیونهاي فلزي در فضاي سلولی از جمله سدیم، امکان اتصال جایگاه فعال آنزیم به NADH - P - و مالات تغییر خواهد کرد. احتمالا سدیم برخلاف یونهاي دایوالانت همچون منگنز و منیزیم باعث کاهش اتصال مالات به آنزیم NADP-Malic میشود - . - 7 طبق آنالیزهاي توالی صورت گرفته مشخص شده است که نواحی هدف براي قلیایی شدن، اسیدآمینه سیستئین در توالی این آنزیم است. بهنظر میرسد این اسیدآمینه در فعالیت آنزیم NADP-Malic اهمیت فراوان داشته باشد - . - pfam.sanger.ac.uk بررسی توالی پروتئینی قطعه جداسازي شده از گندم دوروم، سیستئین را در دو موقعیت
