مقاله در مورد اندازه گیری زیرالنون به روش کروماتوگرافی لایه نازک

بخشی از مقاله

آشنايي با مؤسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران
مؤسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران به موجب قانون، تنها مرجع رسمي كشور است كه عهده دار وظيفه تعيين، تدوين و نشر استانداردهاي ملي (رسمي) ميباشد.
تدوين استاندارد در رشته هاي مختلف توسط كميسيون هاي فني مركب از كارشناسان مؤسسه، صاحبنظران مراكز و مؤسسات علمي، پژوهشي، توليدي واقتصادي آگاه ومرتبط با موضوع صورت ميگيرد. سعي بر اين است كه استانداردهاي ملي، در جهت مطلوبيت ها و مصالح ملي وبا توجه به شرايط توليدي، فني و فن آوري حاصل از مشاركت آگاهانه و منصفانه صاحبان حق و نفع شامل:

توليدكنندگان ،مصرف كنندگان، بازرگانان، مراكز علمي و تخصصي و نهادها و سازمانهاي دولتي باشد.پيش نويس استانداردهاي ملي جهت نظرخواهي براي مراجع ذينفع واعضاي كميسيون هاي فني مربـوط ارسال ميشود و پس از دريـافت نظـرات وپيشنهادهـا در كـميته ملـي مرتبـط بـا آن رشته طرح ودر صورت تصويب به عنوان استاندارد ملي (رسمي) چاپ و منتشر مي شود.

پيش نويس استانداردهايي كه توسط مؤسسات و سازمانهاي علاقمند و ذيصلاح و با رعايت ضوابط تعيين شده تهيه مي شود نيز پس از طرح و بـررسي در كميته ملي مربوط و در صورت تصويب، به عنوان استاندارد ملي چاپ ومنتشرمي گردد. بدين ترتيب استانداردهايي ملي تلقي مي شود كه بر اساس مفاد مندرج در استاندارد ملي شماره ((5)) تدوين و در كميته ملي مربوط كه توسط مؤسسه تشكيل ميگردد به تصويب رسيده باشد.
مؤسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران از اعضاي اصلي سازمان بين المللي استاندارد ميباشد كه در تدوين استانداردهاي ملي ضمن تـوجه به شرايط كلي ونيازمنديهاي خاص كشور، از آخرين پيشرفتهاي علمي، فني و صنعتي جهان و استانداردهـاي بين المـللي استفـاده مي نمايد.
مؤسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران مي تواند با رعايت موازين پيش بيني شده در قانون به منظور حمايت از مصرف كنندگان، حفظ سلامت و ايمني فردي وعمومي، حصول اطمينان از كيفيت محصولات و ملاحظات زيست محيطي و اقتصادي، اجراي بعضي از استانداردها را با تصويب شوراي عالي استاندارد اجباري نمايد. مؤسسه مي تواند به منظور حفظ بازارهاي بين المللي براي

محصولات كشور، اجراي استاندارد كالاهاي صادراتي و درجه بندي آنرا اجباري نمايد.
همچـنين بمنظـور اطـمينان بخـشيدن به استفاده كنندگـان از خـدمات سازمانها و مؤسسات فعال در زمينه مشاوره، آموزش، بازرسي، مميزي و گواهي كنندكان سيستم هاي مديريت كيفيت ومديريت زيست محيطي، آزمايشگاهها و كاليبره كنندگان وسايل سنجش، مؤسسه استاندا

رد اينگونه سازمانها و مؤسسات را بر اساس ضوابط نظام تأييد صلاحيت ايران مورد ارزيابي قرار داده و در صورت احراز شرايط لازم، گواهينامه تأييد صلاحيت به آنها اعطا نموده و بر عملكرد آنها نظارت مي نمايد. ترويج سيستم بين المللي يكاها ، كاليبراسيون وسايل سنجش تعيين عيار فلزات گرانبها و انجام تحقيقات كاربردي براي ارتقاي سطح استانداردهاي ملي از ديگر وظايف اين مؤسسه مي باشد.

كميسيون استاندارد"خوراك دام- اندازه گيري زيرالنون به روش كروماتوگرافي لايه نازك- روش آزمون"
رئيس سمت يا نمايندگي
شجاعي،فريبرز ( دكتري فارموكينتيك ) شركت مرجعان خاتم
اعضا
آرين نمازي،حسين( ليسانس كشاورزي ) شركت ديهيم كوير
بنائي،بهداد ( مهندسي شيمي صنايع غذايي ) شركت آتي نگران پيشگام
حافظي اردكاني،پرتو ( ليسانس شيمي ) اداره كل استاندارد و تحقيقات صنعتي استان كرمان
خالقي،موج ( فوق ليسانس ميكروبيولوژي ) اداره كل استاندارد و تحقيقات صنعتي استان كرمان
دهقاني،فاطمه ( ليسانس شيمي ) اداره كل استاندارد و تحقيقات صنعتي استان كرمان

گلشن،ابوالفضل( فوق ليسانس علوم و صنايع غذايي ) مركز تحقيقات كشاورزي استان كرمان
مشكاني،اعظم السادات( ليسانس زيست شناسي ) شركت مرجعان خاتم
مظاهري،منصوره(فوق ليسانس مهندسي شيمي بيوتكنولوژي ) موسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران
نوروزي،سعيد ( دكتري دامپزشكي ) موسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران

نوري،نغمه( ليسانس صنايع غذايي ) كارخانه فرآورده هاي لبني و دامداري هامون
دبير
علائي،آناهيتا ( فوق ليسانس شيمي ) اداره كل استاندارد و تحقيقات صنعتي استان كرمان
پيش گفتار
استاندارد"خوراك دام – اندازه گيري زيرالنون به روش كروماتوگرافي لايه نازك- روش آزمون"كه توسط كميسيونهاي مربوط تهيه و تدوين شده و در چهارصدوهجدهمين جلسه كميته ملي استاندارد خوراك و فرآورده هاي كشاورزي مورخ 16/12/82 مورد تصويب قرار گرفته است، اينك به استناد بند يك ماده 3 قانون اصلاح قوانين و مقررات موسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران مصوب بهمن ماه 1371 بعنوان استاندارد ملي ايران منتشر مي شود.
براي حفظ همگامي و هماهنگي با تحولات و پيشرفت هاي ملي و جهاني در زمينه صنايع، علوم و خدمات، استانداردهاي ملي ايران در مواقع لزوم تجديد نظر خواهد شد و هر گونه پيشنهادي كه براي اصلاح يا تكميل اين استانداردها ارائه شود، در هنگام تجديد نظر در كميسيون فني مربوط مورد توجه قرار خواهد گرفت . بنابراين براي مراجعه به استانداردهاي ايران بايد همواره از آخرين تجديد نظر آنها استفاده كرد.
در تهيه و تدوين اين استاندارد سعي شده است كه ضمن توجه به شرايط موجود و نيازهاي جامعه

در حد امكان بين اين استاندارد و استاندارد ملي كشورهاي صنعتي و پيشرفته هماهنگي ايجاد شود.
منبع و ماخذي كه براي تهيه اين استاندارد به كار رفته به شرح زير است:
1- ISO 6870: 1985(E) Animal feeding stuffs – Determination of zearalenone content

خوراك دام – اندازه گيري زيرالنون به روش كروماتوگرافي لايه نازك1- روش آزمون
1 هدف
هدف از تدوين اين استاندارد، تعيين روش براي اندازه گيري زيرالنون در خوراك دام ( به ويژه ذرت ) مي باشد.
يادآوري – اگر چه نقاط فلورسانسي كه سورگام2 ايجاد مي كند مشابه با زيرالنون است ولي هنوز از اين روش براي اندازه گيري زيرالنون در خوراك دام استفاده مي شود، زيرا مقادير 3 پس از ظهور كروماتوگرام در جهت دوم متفاوت هستند. اين نقاط فلورسانس سورگام با روش هاي تاييدي مشخص شده در اين استاندارد خاص ظاهر نمي شوند.

2 دامنه كاربرد
حد تعيين مقدار4 برابر 50 ميكروگرم بر كيلوگرم مي باشد.

3 مراجع الزامي
مدارك زير حاوي مقرراتي است كه در متن اين استاندارد به آنها ارجاع داده شده است. بدين ترتيب آن مقررات جزئي از اين استاندارد محسوب مي شود. در مورد مراجع داراي تاريخ چاپ و/ يا تجديدنظر، اصلاحيه ها و تجديدنظرهاي بعدي اين مدارك مورد نظر نيست. معهذا بهتر است كاربران ذينفع اين استاندارد ، امكان كاربرد آخرين اصلاحيه ها و تجديدنظرهاي مدارك الزامي زير را مورد

بررسي قرار دهند. در مورد مراجع بدون تاريخ چاپ و/ يا تجديدنظر، آخرين چاپ و/ يا تجديدنظر آن مدارك الزامي ارجاع داده شده مورد نظر است.
استفاده از مراجع زير براي كاربرد اين استاندارد الزامي است:
3-1 استاندارد ملي ايران 3021 : سال 1374 خوراك دام-آماده سازي نمونه آزمايشگاهي.
3-2 استاندارد ملي ايران 2707 : سال 1381 آفلاتوكسين هاي گروه M,G,B- روش آزمون-تعيين غلظت و درجه خلوص به روش اسپكتروفتومتري.
3-3 استاندارد ملي ايران 5925 : سال1380 خوراك انسان- دام -بيشينه رواداري مايكوتوكسين ها.
3-4 ISO 5725-1,2 :1994 Accuracy ( trueness and precision ) of measurement methods and results.
3-5 ISO 6497: 2002 Animal feeding stuffs- Sampling
4 اصطلاحات و تعاريف
در اين استاندارد اصطلاحات و/ يا واژه ها با تعاريف زير به كار مي رود:
4-1 زيرالنون
سمي است كه عمدتا توسط گونه هايي از قارچ فوزاريوم1 مانند: فوزاريوم گراميناروم2 و فوزاريوم كالموروم3 ،توليد مي گردد.
4-2 كروماتوگرافي لايه نازك
كروماتوگرافي روشي براي جداسازي اجزاي يك مخلوط مي باشد. در اين روش كروماتوگرافي، فاز ساكن شامل ذرات جاذب سيليكاژل، آلومينا و فلوريزيل است، كه روي يك صفحه نازك پوشش داده شده است. فاز متحرك با عبور از فاز ساكن بر اساس خاصيت مويينگي موجب جداسازي اجزاي يك مخلوط مي گردد.
4-3 نمونه شاهد
به نمونه اي گفته مي شود، كه بدون آلودگي به زيرالنون بوده و تمامي مراحل اين آزمون را براي كسب اطمينان از عدم آلودگي، بر روي آن انجام شده باشد.
4-4 تخليص

به حذف چربي، پيگمان رنگي و يا مواد مداخله گر موجود در نمونه استخراج شده، گفته مي شود.
4-5 استخراج1
به جداسازي سم از نمونه مورد آزمون از طريق انحلال سم در يك حلال و يا مخلوطي از حلال هاي مناسب، گفته مي شود.
4-6 صحت2
به نزديكي يا توافق بين نتايج آزمون با ميزان واقعي كه در نمونه وجود دارد، گفته م

ي شود.
4-7 دقت3
به نزديكي يا توافق بين نتايج آزمون هاي مستقل، كه تحت شرايط مقرر شده انجام شده باشد، گفته مي شود.
تكرارپذيري1 و تجديدپذيري2، روش هايي براي تعيين دقت روش آزمون مي باشد.
4-8 تكرارپذيري ( r )
به نزديكي يا توافق بين نتايج حاصل از تجزيه مكرر يك نمونه به وسيله يك روش آزمون، تحت شرايط مشابه در زمان هاي نزديك به هم، گفته مي شود.
4-9 تجديدپذيري ( R )
به نزديكي يا توافق بين نتايج حاصل از تجزيه مكرر يك نمونه كه به وسيله يك روش آزمون،تحت شرايط مختلف مانند: آزمايش كننده، دستگاه و آزمايشگاه انجام شده باشد، گفته مي شود.
4-10 آماده سازي نمونه3
به همه كارهايي گفته مي شود، كه پيش از انجام آزمون روي نمونه آزمايشگاهي صورت مي گيرد، مانند: آسياب كردن، مخلوط كردن، يكنواخت كردن، پخش كردن و ... .
4-11 نمونه آزمايشگاهي4
به بخشي از نمونه كه براي آماده سازي و انجام آزمون به آزمايشگاه فرستاده مي شود،گفته مي شود.
4-12 آزمايه5
به بخشي از نمونه آزمايشگاهي كه براي انجام آزمون آماده شده است، گفته مي شود.
4-13 آزمونه1
بخشي از آزمايه است، كه آزمايش بر روي آن انجام مي گيرد.
4-14 محلول استاندارد كاري زيرالنون
محلولي استاندارد از زيرالنون در بنزن است، كه غلظتي برابر با 10 ميكروگرم در ميلي ليتر داشته باشد.

5 مواد لازم
تمام مواد و معرف هاي مورد استفاده بايستي داراي درجه خلوص تجزيه اي بوده و آب مورد استفاده در آزمايش، بايد آب مقطر و يا با خلوص مشابه با آن باشد.
5-1 استونيتريل
5-2 ايزو - اكتان
5-3 كلروفرم

5-4 بنزن – استونيتريل ( 2 + 98 )
98 ميلي ليتر از بنزن را با 2 ميلي ليتر استونيتريل مخلوط كنيد.
توجه – بنزن قابل اشتعال بوده و همين ماده اي سمي است. بايد از استنشاق و تماس آن با پوست بدن جلوگيري شود.
5-5 حلال هاي ظهور
6 ميلي ليتر تولوئن را با 3 ميلي ليتر اتيل استات و 1 ميلي ليتر فورميك اسيد، مخلوط كنيد.
5-5-2 مخلوط كلروفرم – اتانول (5+95 )
95 ميلي ليتر كلروفرم را با 5 ميلي ليتر اتانول، مخلوط كنيد.
5-6 محلول 40 گرم در ليتر پتاسيم كلرايد
5-7 محلول استات سرب
200 گرم استات سرب را در يك بالون حجمي يك ليتري مدرج ريخته و به آن سه ميلي ليتر استيك اسيد اضافه كنيد. سپس با آب مقطر به حجم رسانده و مخلوط نماييد.
5-8 معرف بنزيدين 1
توجه – بنزيدين سرطان زا مي باشد و بر اثر تنفس، تماس با پوست و خوردن ايجاد مسموميت مي كند.
5-8-1 تهيه محلول بنزيدين با غلظت 5 گرم بر ليتر
5/0 گرم بنزيدين را وزن كرده و به يك بالون 100 ميلي ليتري حاوي 20 ميلي ليتر آب و 5/1 ميلي ليتر هيدرو كلريك اسيد بريزيد و با آب به حجم برسانيد. محلول حاصل را در بطري شيشه اي تيره رنگ و دور از نور، نگهداري كنيد.
5-8-2 تهيه معرف
حجم هاي مساوي از محلول بنزيدين ( طبق بند 5-8-1 ) و محلول نيتريت سديم با غلظت 100 گرم بر ليتر را تا دماي بين صفر درجه و منفي پنج درجه سلسيوس، سرد كنيد.
محلول ها را كاملا مخلوط كرده تا به رنگ بنفش تيره و كدر درآيد. سپس اجازه دهيد تا دماي محلول به دماي اتاق برسد. در اين حالت، رنگ محلول زرد شده و قابل استفاده است.
اين محلول بايد پيش از استفاده تهيه شود.
5-9 خاك دياتومه ( Celite 545 ) شسته شده با هيدروكلريك اسيد
5-10 نيتروژن
5-11 محلول استاندارد زيرالنون با غلظت 10 ميكروگرم در ميلي ليتر، حل شده در بنزن.
بوسيله اسپكترومتر، طيف جذبي اين محلول را در طول موج 300 و 320 نانومتر و با استفاده از سل هاي نوري سيليكاي 10 ميلي متري و بنزن، بعنوان شاهد اندازه گيري نماييد. بيشينه جذب A را كه در حدود 317 نانومتر است، ثبت كنيد. با استفاده از فرمول 1 به شرح زير، غلظت زيرالنون در محلول را، بر حسب ميكروگرم بر ميلي ليتر محاسبه كنيد:
فرمول (1)

كه در فرمول1 318 ، جرم مولي زيرالنون ,6060 ضريب مولي1, A بيشينه جذب وC غلظت
زيرالنون بر حسب ميكروگرم بر ميلي ليتر مي باشد.
6 وسايل لازم
وسايل معمول آزمايشگاهي و به ويژه وسايل زير:

6-1 آسياب، مناسب براي تهيه نمونه اي كه به طور كامل از الك با قطر چشمه هاي يك ميلي متري بگذرد.
6-2 شيكر، مناسب براي ايجاد 100 حركت نوساني در دقيقه.
6-3 كاغذ صافي، درجه متوسط (در صورت استفاده از كاغذ صافي با عبور سريع، محلول كدر حاصل مي شود و در صورت استفاده از كاغذ صافي با عبور كند، احتمال انسداد آن خواهد بود).
6-4 دستگاه تبخير دوار با بالون ته گرد
6-5 وسايل كروماتوگرافي لايه نازك

يعني: وسايل مورد نياز براي تهيه پليت (طبق بند 6-6) و لكه گذاري (پيپت هاي كپيلاري يا
سرنگ هاي ميكروليتري )، تانك ظهور و تجهيزات لازم براي اسپري معرف ( طبق بند 5-8 ) روي پليت.
6-6 پليت هاي كروماتوگرافي لايه نازك، با ابعاد 200 × 200 ميلي متر بدون فلورسانس كه به صورت تجاري موجود مي باشند. در صورت نياز مي توان پليت ها را به صورت زير تهيه نمود ( مواد نوشته شده براي تهيه پنج پليت كافي مي باشند).
30 گرم سيليكاژل G-HR را در يك بالون مخروطي وزن كرده و به آن 60 ميلي ليتر آب اضافه كنيد، در آن را بسته و به مدت زمان يك دقيقه بخوبي تكان دهيد. سپس دوغاب حاصل را به گونه اي بروي پليت ها پخش كنيد، كه لايه يكنواختي با قطر25/0 ميلي متر حاصل شود. اجازه دهيد تا در مجاورت هوا خشك شود، آنگاه آنها را در دسيكاتور نگهداري نماييد و صفحات را هنگام استفاده براي مدت زمان يكساعت در آون در دماي 110 درجه سلسيوس فعال نماييد.
يادآوري- توصيه مي شود از پليت هاي تجاري استفاده شود.
6-7 لامپ UV با طول موج كوتاه ( طول موج 253 نانومتر )
شدت تابش بايد به گونه اي باشد، كه در فاصله 100 ميلي متري لامپ از صفحه، بتوان لكه 25 نانوگرمي زيرالنون را به روشني تشخيص داد.
توجه – با توجه به خطرزايي نورUV براي چشم ها, بايد در هنگام كار از محافظ براي چشم استفاده نمود.
6-8 لوله آزمايش, 10 ميلي ليتري با درپوش پلي اتيلني.
6-9 فلورودانسيتومتر
6-10 حمام آب, قابل تنظيم در دماي 60 درجه سلسيوس.
6-11 بالون حجمي, 500 ميلي ليتري با در سمباده اي.
6-12 قيف جداكننده, 250 ميلي ليتري.
6-13 استوانه مدرج , 100 و 250 ميلي ليتري.
6-14 پي پت, 50و100 ميلي ليتري.
6-15 سرنگ ميكروليتري.

7 نمونه برداري
نمونه برداري بايست مطابق با استاندارد ملي ايران .... انجام شود1.

8 اساس روش
اساس كار اين روش، عصاره گيري از آزمونه با مخلوطي از استونيتريل و محلول پتاسيم كلرايد، صاف كردن، برداشتن حجم مشخصي از محلول و چربي زدايي با ايزواكتان و سپس خالص كردن درمخلوطي از استونيتريل،آب و استات سرب در حضور خاك دياتومه مي باشد.پس از صاف كردن

،
حجمي از محلول حاصل با كلروفرم استخراج شده و سپس تبخير مي گردد.
عصاره خشك حاصل از تبخير، در مخلوطي از بنزن و استونيتريل حل شده و حجم مشخصي از آن براي كروماتوگرافي لايه نازك دو جهته2به كار مي رود. در نهايت مقدار زيرالنون با روش چشمي و يا به وسيله شدت سنجي نور فلورسانس نقاط زير تابش نورUV ( ماورا بنفش ) در مقايسه با غلظت مشخص زيرالنون لكه گذاري شده بروي همان صفحه، اندازه گيري مي شود.
تست تاييدي براي زيرالنون بوسيله معرف بنزيرين انجام مي گيرد.

9 روش اجراي آزمون
9-1 آماده سازي آزمايه
‌‌نمونه آزمايشگاهي بايد به گونه اي آسياب شود، كه تمامي آن از الك با قطر چشمه يك ميلي متر عبور نمايد. سپس آن را كاملا مخلوط كرده و آزمايه را از آن تهيه كنيد.
9-2 آزمونه
50 گرم از آزمايه را با دقت 01/0 گرم در يك بالون حجمي ( طبق بند 6-11 )، وزن كنيد.
9-3 استخراج
180 ميلي ليتر استونيتريل ( طبق بند 5-1 ) و20 ميلي ليتر از محلول پتاسيم كلرايد (طبق بند 5-6 ) را بوسيله استوانه مدرج ( طبق بند 6-13 ) داخل بالون بريزيد. سپس در بالون را بسته و آنرا به مدت زمان 30 دقيقه به كمك شيكر ( طبق بند 6- 2 )، به هم بزنيد. مخلوط را بر روي يك كاغذ
صافي ( طبق بند 6-3 )، صاف كنيد.
بوسيله يك پيپت ( طبق بند 6-14 )، 100 ميلي ليتر از محلول صاف شده را به قيف جداكننده (طبق بند 6-12) بريزيد و طي دو مرحله استخراج هر بار با50 ميلي ليتر ايزواكتان (طبق بند 5-2) ، چربي زدايي كنيد.
فاز استونيتريل را در بالون ته گرد دستگاه تبخير دوار ( طبق بند 6-4 )، جمع آوري نموده و سپس آن را تحت فشار پايين تا حد خشك شدن تبخير كنيد.
9-4 تخليص
بوسيله يك استوانه مدرج ( طبق بند6-13)20 ميلي ليتر استونيتريل ( طبق بند 5-1 )، 60 ميلي ليتر آب و 20 ميلي ليتر محلول استات سرب ( طبق بند 5-7 ) را به باقيمانده تبخير بيافزاييد. سپس مخلوط را بهم زده و آنرا به مدت زمان 10 دقيقه در حمام آب ( طبق بند 6-10 ) با دماي 60 درجه سلسيوس قرار دهيدتا فازها جدا شوند. در اين مرحله، رسوب تشكيل مي گردد . 5 گرم خاك دياتومه ( طبق بند 5-9 ) به آن افزوده و سپس با استفاده از كاغذ صافي ( طبق بند 6-3 ) صاف كنيد.
بوسيله يك پيپت ( طبق بند 6-14 ) ، 50 ميلي ليتر از محلول صاف شده را به يك قيف جداكننده
(طبق بند 6-12) بريزيد و عمل استخراج را سه بار، هر بار با50 ميلي ليتر كلروفرم (طبق بند5-3)، انجام دهيد. فاز كلروفرمي را از سولفات سديم عبور دهيد تا رطوبت زدايي شود. سپس آن را در بالون ته گرد دستگاه تبخير دوار ( طبق بند 6-4 )، جمع آوري كرده و تحت فشار پايين تا حد خشك شدن تبخير نماييد.
حاصل از تبخير را با شستشو بوسيله كلروفرم به لوله آزمايش ( طبق بند 6-8 ) بريزيد و در حمام آب ( طبق بند 6-10 )تحت جريان نيتروژن ( طبق بند 5-10 ) تا حد خشك شدن تبخير كنيد.
سپس 5/0 ميلي ليتر از مخلوط بنزن استونيتريل ( طبق بند 5-4 ) را بوسيله سرنگ ميكروليتري با احتياط به لوله افزوده و در آنرا محكم ببنديد و خوب مخلوط نماييد.
9-5 كروماتوگرافي لايه نازك دو جهتي

9-5-1 لكه گذاري محلول ها ( شكل 1 )
روي پليت ( طبق بند 6-6 ) دو خط مستقيم عمود بر هم رسم نموده، به گونه اي كه ، هر كدام از اين خطوط به ترتيب 50 و 60 ميلي متر از كناره هاي پليت فاصله داشته باشند. اين خطوط جهت نشان دادن حد جابجايي حلال رسم مي شوند. با استفاده از سرنگ ميكروليتري از عصاره نمونه و محلول هاي استاندارد مورد آزمون، مقادير زير را لكه گذاري نماييد:
- در نقطه A , 25 ميكروليتر از عصاره خالص شده ( طبق بند 9-4 ).
- در نقطه B , 10 ميكروليتر از محلول استاندارد ( طبق بند 5-11 ).
- در نقطه D , 10 ميكروليتر از محلول استاندارد ( طبق بند 5-11 ).
- در نقطه E , 15 ميكروليتر از محلول استاندارد ( طبق بند 5-11 ).
پليت را با جريان هوا يا نيتروژن ( طبق بند 5-10 ) خشك كنيد. لكه ها بايد بيشينه داراي قطري برابر 5 ميلي متر باشد.

9-5-2 ظهور ( به شكل 1 توجه نماييد )
پليت را در جهت با استفاده از حلال ظهور ( طبق بند 5-5-1 ) ( ارتفاع حلال در تانك اشباع برابر 10 ميلي متر ) در محل تاريك ظاهر نماييد تا زمانيكه حلال تا خط نشانه برسد. پليت را از تانك خارج كرده و به مدت زمان كمينه 15 دقيقه در دماي معمولي در محل تاريكي قرار دهيد تا خشك شود.
يادآوري – بهتر است كه كروماتوگرام پس از ظهور در جهت ، در زير نور ماوراء بنفش با طول موج 253 نانومتر بررسي شده و لكه هاي زيرالنون با يك مداد علامت گذاري شوند ( لكه در نقطه B محل زيرالنون را نشان مي دهد ).
سپس پليت را در جهت با استفاده از حلال ظهور ( طبق بند 5-5-2 ) ( ارتفاع حلال در تانك اشباع برابر 10 ميلي متر ) در محل تاريك ظاهر نماييد تا زمانيكه حلال تا خط نشانه بالا بيايد. پليت را از تانك خارج نموده در محل تاريك در دماي معمولي قرار دهيد تا خشك شود.

شكل 1 - لكه گذاري محلولها و ظهور كروماتوگرام
9-6 روش تعيين ميزان زيرالنون
براي تشخيص و تعيين ميزان زيرالنون دو روش چشمي و فلورودانسيتومتري قابل اجرا مي باشد، كه در صورت وجود امكانات لازم روش دوم برتري دارد.
9-6-1 روش اندازه گيري چشمي
در اين روش، مقدار زيرالنون موجود در نمونه از طريق مقايسه شدت فلورسانس لكه هاي مربوط به عصاره و لكه هاي E,D,C ، استانداردها در زير نور ماورا بنفش تعيين مي گردد. پليت بايد در فاصله10سانتي متري از لامپUV (طبق بند 6-7) قرار داده شود. ولي در صورت نياز ( وصل كردن نقاط با رسم خط ) انجام گيرد.
اگر شدت فلورسانس عصاره 25 ميكروليتري بيش از شدت فلورسانس محلول استاندارد 15 ميكروليتري باشد, حجم كمتري را در نقطهA لكه گذاري كنيدو يا عصاره مورد آزمون را با استفاده از مخلوط بنزن - استونيتريل ( طبق بند 5-4 ) رقيق نموده و مجددا عمليات كروماتوگرافي لايه نازك را تكرار كنيد.
9-6-2 روش اندازه گيري با فلورودانسيتومتر
شدت فلورسانس لكه ها را با استفاده از دستگاه فلورودانسيتومتر ( طبق بند 6-9 ) در ,به طور مثال: طول موج تهييج 313 نانومتر و طول موج نشر 443 نانومتر (بيشينه نشر 470 نان

ومتر)، اندازه گيري كنيد.
مقدار زيرالنون در لكه عصاره مورد آزمون از طريق مقايسه شدت فلورسانس آن با لكه هاي E,D,Cمحلول استاندارد، تعيين مي شود.
9-7 آزمون تاييدي براي زيرالنون
پليت ظاهر شده در بند 9-5 را با معرف بنزيدين ( طبق بند 5-8 )، اسپري نماييد. در صورت وجود زيرالنون, لكه هاي قرمز آجري روشن در دماي اتاق ايجاد شده كه پس از قرار گرفتن در برابر هوا بمدت زمان كمينه 15 دقيقه, رنگ آن محو مي شود.

10 بيان نتايج
10-1 اندازه گيري چشمي
مقدار زيرالنون, بر حسب ميكروگرم در كيلوگرم محصول، با استفاده از فرمول2 به شرح زير به دست مي آيد:
فرمول (2)

در فرمول2 :
: غلظت زيرالنون در محلول استاندارد ( طبق بند 5-11 )، بر حسب ميكروگرم در ميلي ليتر.
: جرم آزمونه بسته به حجم عصاره خالص شده، بر حسب گرم.
: حجم نهايي عصاره با توجه به ميزان رقيق سازي, بر حسب ميكروليتر.
: به ترتيب حجم لكه عصاره و حجم لكه محلول استاندارد زيرالنون كه شدت هاي نور فلورسانس مشابه دارند, بر حسب ميكروليتر.
10-2 اندازه گيري فلورودانسيتومتري
غلظت هاي 1000، 4000، 10000، 20000 و40000 نانوگرم بر ميلي ليتر از استاندارد زيرالنون را با در نظر گرفتن كليه شرايط لكه گذاري و ظهور بر روي صفحه كروماتوگرافي لكه گذاري نموده و صفحه را ظاهر كنيد. منحني كاليبراسيون را به طوري كه روي محور Y تغييرات مربوط به غلظت استاندارد زيرالنون بر حسب نانوگرم و محور X تغييرات مربوط به علامت پيك باشد، رسم نماييد. جرم زيرالنون در نمونه با استفاده از معادله محاسبه مي گردد كه در آن a شيب خط منحني كاليبراسيون و bعرض از مبدا مي باشد. مقدارزيرالنون بر حسب ميكروگرم در كيلوگرم محصول، با استفاده از فرمول3 به شرح زير به دست مي آيد:
فرمول (3)

در فرمول3 :
: جرم آزمونه كه متناسب با حجم عصاره خالص شده باشد، بر حسب گرم ( 5/12 گرم ).
: جرم زيرالنون در لكه عصاره ( با توجه به حجم ) به دست آمده از اندازه گيري, برحسب نانوگرم.
: حجم نهايي عصاره با توجه به ميزان رقيق سازي, بر حسب ميكروليتر.
: حجم عصاره لكه گذاري شده روي پليت, بر حسب ميكروليتر ( 25 ميكروليتر ).

11 دقت

نتايج آماري حاصل از آزمون هاي بين آزمايشگاهي كه در تعداد 20 آزمايشگاه انجام گرفته، در جدول1 نشان داده شده است. لازم به يادآوري است، كه هر آزمايشگاه سه آزمون مطابق با استاندارد بين المللي ايزو 5725 سال 1994، انجام داده است( 2 )، همچنين 16 مورد از نتايج براي ذرت B كاربرد دارند.

جدول 1 – نتايج بر حسب ميكروگرم در كيلوگرم
نمونه ذرت A B
( نمونه A كه تا سه بار رقيق شده است )

تعداد آزمايشگاه هاي باقيمانده پس از حذف نتايج مشكوك. 20 15
ميانگين. 734 219
انحراف معيار استاندارد براي تكرارپذيري, .
ضريب تغيير تكرارپذيري.
تكرارپذيري, 83/2.
78
11%
221 34
15%
96

انحراف معيار استاندارد براي تجديدپذيري, .
ضريب تغيير براي تجديدپذيري.
تكثيرپذيري, 83/2.
282
38%
798 125
57%
354

12 گزارش آزمون
گزارش آزمون بايد داراي آگاهي هاي زير باشد:
12-1 روش آزمون طبق استاندارد ملي ايران .......... .
شرح نتايج به دست آمده.

علاوه بر نتايج به دست آمده، بايد تمامي جزئيات عملي كه در استاندارد ملي ايران ....... بيان نشده و يا اختياري تلقي شده است، همراه با جزئيات هر رخدادي كه ممكن است تاثيري بر نتايج آزمون داشته باشد نوشته شود.
گزارش آزمون، بايد شامل تمامي جزئيات لازم براي شناسايي كامل نمونه باشد.
تاريخ انجام آزمون.
نام و نام خانوادگي و امضا آزمايش كننده.