بخشی از مقاله
میکروسکوپهای فلورسانت
مقدمه
یکی از مهمترین میکروسکوپهای مورد استفاده در علوم بیولوژیکی میکروسکوپ فلورسانت می‌باشد. این میکروسکوپ دارای ویژگیهای منحصر به فردی می‌باشد که موجب تمایز آن از دیگر انواع میکروسکوپها می‌شود. با استفاده از این میکروسکوپها می‌توان موادی را که فلورسانت هستند و از خود نور تولید می‌کنند آشکار نمود و مشاهده کرد. با استفاده از این میکروسکوپ و خاصیت
فلورسانت مواد می‌توان اجزای داخلی سلولها و یا مواد مختلف را بطور مجزا مشاهده نمود و تصویر گرفت و با توجه به این ویژگی که می‌توان اجزای داخل سلول را رنگ آمیزی نمود می‌توان مثلا قطر یک مولکول DNAS که چیزی در حدود nm 2 است را پس از رنگ آمیزی با ماده فلورسانت با
میکروسکوپهای نوری بسیار کمتر از این حد nm 200 می‌باشد. بنابراین با این گونه میکروسکوپها می‌توان نمونه‌های را مشاهده نمود که ابعاد آن بسیار کوچکتر از قدرت تفکیک میکروسکوپها می‌باشد. علاوه بر اینها با توجه به آنکه نور تابش یافته از مواد فلورسانت دارای طول موجهای مشخص می‌باشند می‌توان از نور حاصله اطلاعات کمی و کیفی متعددی بدست آورد و در تحلیل نحوه کار سلول بکار برد.
پدیده فلورسانت
بعضی مواد موقعی که مورد تابش نور ، گرما و یا اصطکاک قرار می‌گیرند این نوع انرژیها را جذب و سپس آن را بصورت نور از خود تابش می‌نمایند. این گونه مواد را مواد لومینسانس و این پدیده را پدیده لومینسانس می‌نامند. علت این پدیده آن است که اتمها در اثر انرژی خارجی تحریک شده و سپس بعد از آنکه عامل تحریکی از بین رفتن اتمها به حالت پایدار بر می گردند که در این صورت انرژی اضافی الکترونهای تحریکی بصورت نور آزاد می‌شوند. شرط ایجاد فوتونهای لومینسانس آن است که انرژی تابشی بیشتر از انرژی فلورسانت باشد. در واقع برای آنکه انرژی تابشی بتواند موجب تحریک اتمها شود بایستی انرژی تابشی بیشتر از حد معینی باشد تا بتواند اتمها را به حالت تحریکی منتقل نماید، زیرا انرژی لایه‌های الکترونی از اتمها ناپیوسته و منفصل می‌باشد.
بر حسب آنکه زمان بازتابش فوتونهای فلورسانت پس از دریافت انرژی تابشی چه مدت باشد معمولا عناصری که دارای خاصیت لومینسانس هستند را به دو دسته فلورسانت و فسفرسانس تقسیم می‌نمایند. مواد فلورسانت موادی هستند که زمان بازتابش انرژی آنها کمتر از -810 ثانیه پس از جذب انرژی توسط ماده فلورسانت باشد. در صورتی که زمان بازتابش بیشتر از این باشد این ماده را فسفرسانت می‌نامند. در میکروسکوپی فلورسانت معمولا جهت تحریک اتمهای فلورسانت از نور استفاده می‌شود.
تابش فلورسانتی
همان طوری که گفته شد به منظور آنکه بتوان اتمهای ماده فلورسانت را تحریک نمود انرژی فوتونهای تابشی به ماده فلورسانت بایستی دارای انرژی بیشتری نسبت به فوتونهای تابش یافته از ماده فلورسانت باشد و لذا معمولا از نور UV جهت تحریک اتمهای فلورسانت استفاده می‌شود. متذکر می‌شود اتمهای فلورسانت که بوسیله میکروسکوپ فلورسانت تصویرگیری می‌شوند پس از دریافت نور UV ایجاد نور مرئی با طول موج بلندتر می‌نماید. شدت نور فلورسانت تابش یافته معمولا ب
سیار کمتر از نور تابشی به ماده فلورسانت (کمتر از 01/0 درصد) می‌باشد. علاوه بر آن نور فلورسانت ایجاد شده پس ار تابش از ماده فلورسانت در تمام جهات پراکنده می‌شوند و بدین لحاظ درصد کمی از آنها به چشم می‌رسد. شدت نور فلورسانت تابش یافته اولا به شدت نور محرک و ثانیا با غلظت ماده فلورسانت و همچنین با ضریب فلورسانت ماده متناسب می‌باشد.
ضمنا نور تابش یافته همانطوری که قبلا گفته شده وابسته به نوع ماده می‌باشد، بنابراین انرژی و طول موج و بالطبع رنگ ظاهر شده مخصوص خود آن ماده می‌باشد. علاوه بر آن نور حاصله تا حدی پلاریزه می‌باشد. با توجه به این ویژگیها می‌توان در تصویرگیری فلورسانت از میکروسکوپهای فلورسانت استفاده نمود. در میکروسکوپهای فلورسانت اساسا با توجه به آنکه هر ماده فلورسانت ماکزیمم جذب را در طول موج بخصوصی دارد، بنابراین طول موج تابشی به ماده بایستی طول موج با جذب ماکزیمم در آن ماده فلورسانت باشد و در ضمن موقع مشاهده تصویر بایستی تا از نورهایی که در اثر ماده فلورسانت ایجاد می‌شود استفاده شود.
اجزاء اصلی میکروسکوپ فلورسانت
اجزای اصلی میکروسکوپ فلورسانت نسبت به میکروسکوپهای معمولی عبارتند از:
منبع نور
منبع نور مورد استفاده در میکروسکوپ فلورسانت بایستی تولید کننده طول موجهای ناحیه ماورابنفش با شدت زیاد باشد. مهمترین چشمه نوری مورد استفاده لامپ جیوه با فشار زیاد می باشد. معمولا در میکروسکوپهای دیاسکوپیک (diascopic) از لامپهای 200 واتی و در میکروسکوپهای ایپسکوپیک از لامیهای 100 واتی استفاده می‌شود. از لامپهای اگزنون نیز در فلوئورومتری استفاده می‌شوند. در مواردی که شدت نور UV مورد نیاز باشد از لامپهای هالوژن نیز استفاده می‌شود.
فیلترها
همانطوریکه قبلا متذکر شدیم در مشاهدات میکروسکوپی فلورسانت نمونه مورد مطالعه بایستی تنها مورد تابش نور جذبی نمونه قرار گیرد. بدین لحاظ به منظور تابش نور جذبی بایستی طول موجهای دیگر را از پرتوهای تابشی به نمونه نمود. برای این کار معمولا از فیلترها استفاده می‌شود. این فیلترها تنها طول موجهای بخصوصی را از خود عبور میدهند. فیلترهای مورد استفاده در میکروسکوپهای فلورسانت یا از نوع فیلترهای شیشه‌ای رنگی و یا فیلترهای تداخلی می‌باشند
. فیلترهای شیشه‌ای ممکن است به گونه‌ای ساخته شوند که بتوانند باند نسبتا وسیعی از طول موجها را از خود عبور دهند و یا آنکه ممکن است تنها گروه محدودی از طول موجها را از خود عبور دهند. این گونه فیلترها معمولا ارزان می‌باشند. نوع فیلترهای تداخلی دارای کیفیت بسیار بهتری می‌باشند.
با استفاده از این فیلترها می‌توان پهنای باند محدودی از طول موجها را عبور داد. این گونه فیلترها معمولا با توجه به تداخلهای متوالی بین لایه‌های نازک شفاف که دارای ضریب شکست متفاوت هستند ساخته می‌شوند. این گونه فیلترها را می‌توان به گونه‌ای ساخت که بتواند دارای طیف عبوری با پهنای نازک ، متوسط و پهن باشد. این گونه فیلترها معمولا گران قیمت می‌باشند.
زمینه تاریک نوری
با توجه به آنکه نور فلورسانت ایجاد شده بوسیله نمونه بسیار ضعیف می‌باشد، اساسا بایستی سیستم میکروسکوپ فلورسانت به گونه‌ای باشد که نور مستقیم تابشی از چشمه نور به چشم نرسد. این مکانیسم را زمینه تاریک نوری می‌نامند.
نمونه فلورسانت
همانطوری که مشخص است نور مورد استفاده در ایجاد تصویر در نمونه‌های مورد بررسی در میکروسکوپ فلورسانت نور حاصله از نمونه است. بنابراین نمونه بایستی یا فلورسانت باشد و یا به طریقه رنگ آمیزی بصورت فلورسانت تبدیل شود. میکروسکوپهای فلورسانت معمولا دو گونه می‌باشند یک نوع میکروسکوپ فلورسانت دیاسکوپیک و نوع دیگر میکروسکوپ فلورسانت اپیسکوپیک می باشد. متذکر می‌شود نوع میکروسکوپ دیاسکوپیک قبل از میکروسکوپ اپیسکوپیک معمول گردید و لیکن پیشرفتهای بعدی موجب ساخت میکروسکوپهای فلورسانت اپیسکوپیک گردید. این نوع میکروسکوپها دارای ویژگیهای متعددی است که موجب برتری آنها نسبت به نوع قبلی گردیده است.
در سیستم میکروسکوپ دیاسکوپیک در سمت چشمه نور فلورسانت یک فیلتر مناسب واقع می‌شود که از این فیلتر نور و طول موج مناسب عبور می‌نماید. پس از آن نور عبور نموده بوسیله یک کندانسور زمینه تاریک جمع آوری و به نمونه تابیده می‌شود. واضح است که این نور دارای طول موج مناسب جهت جذب در نمونه می‌باشد. پس از تابش نور به نمونه نور فلورسانت ایجاد شده توسط آن در تمام جهات پراکنده می‌شود که پس از آن با استفاده از فیلتر مناسب نور فلورسانت حاصله از نمونه و نور تابش یافته از چشمه نور جدا شده و تنها نور فلورسانت از فیلتر عبور نموده و به چشم
بیننده می‌رسد. کندانسورهای مورد استفاده در میکروسکوپهای دیاسکوپیک معمولا دارای دو نوع خشک و ایمرسیون روغنی می‌باشند. در نوع ایمرسیون روغنی میزان روشنایی منتقل شده به نمونه تا حدود دو برابر بیشتر از نوع کندانسور خشک می‌باشد. کندانسورهای مورد استفاده در میکروسکوپهای فلورسانت دیاسکوپیک از نوع زمینه تاریک می‌باشند. چشمه نوری مناسب مورد استفاده در این میکروسکوپها معمولا از لامپهای جیوه‌ای با توان W200 می‌باشد.
نکته قابل ذکر دیگر در مورد لام می باشد. بایستی دقت نمود که لام مورد استفاده نبایستی دارای ضخامت زیاد باشد زیرا موجب آن خواهد شد که در اثر شکست زیاد نور در آن نور بر روی نمونه متمرکز نشود و لذا تصویر تیره باشد.
میکروسکوپهای اپیسکوپیک دارای تفاوتهایی در مقایسه با میکروسکوپ دیاسکوپ می‌باشد. این میکروسکوپها خود بر دو نوع میکروسکوپ اپیسکوپ مستقیم و معکوس می‌باشد و در نوع مستقیم نور از چشمه نوری بوسیله یک آینه پس از عبور فیلتر و عبور از فیلتر طول موجهایی مناسب به اندازه 90 درجه منحرف شده و از بالا پس از عبور از عدسی شیئی به نمونه می‌تابد. در این میکروسکوپها عدسی شیئی کار کندانسور را نیز انجام می‌دهد. پس از تابش نور به نمونه و ایجاد نور فلورسانت بخشی از این نور بوسیله عدسی شیئی جمع آوری و پس از عبور از فیلتر ، نور UV آن حذف و سپس نور فلورسانت بوسیله عدسی چشمی به چشم بیننده منتقل می‌شود.
همانطوری که در بالا ذکر شد عدسی شیئی در میکروسکوپهای فلورسانت اپیسکوپیک به عنوان کندانسور نیز می باشد. بنابراین در این میکروسکوپها عدسی شیئی بایستی شفاف به نور UV باشد و ضمنا این عدسیها نبایستی خود فلورسانت باشند. بعضی از انواع عدسیهای شیئی که جهت استفاده در میکروسکوپهای فلورسانت اپیسکوپیک در بازار موجود است عبارتند از:
یکی از عوامل مؤثر در روشنایی تصویر در میکروسکوپهای فلورسانت عدد روزنه (N.A) می‌باشد. معمولا افزایش روشنایی تصویر با توان دوم N.A متناسب می‌باشد. روشنایی تصویر همچنین با عکس توان دوم بزرگنمایی (M) متناسبی می‌باشد. با افزایش بزرگنمایی شدت روشنایی تصویر تغییر می‌نماید. تصاویر حاصله با میکروسکوپهای اپیسکوپیک معمولا دارای روشنایی بیشتر و
همچنین بزرگنمایی بیشتری در مقایسه با میکروسکوپهای دیاسکوپیک می‌باشند. منابع روشنایی برای میکروسکوپهای اپیسکوپیک معمولا لامپهای جیوه‌ای W50 یا W100 می‌باشد. در این میکروسکوپها بمنظور تنظیم نور معمولا از دیافراگم روزنه ای و دیافراگم زمینه ای می توان استفاد
ه نمود. در میکروسکوپهای اپیسکوپ نیز مشابه با نوع دیگر میکروسکوپهای UV از روشی ایمرسیون روغنی استفاده می‌شود. مایع مناسب مورد استفاده معمولا گلسیرین می‌باشد. گلسیرین دارای ویژگیهایی می‌باشد که می‌تواند توجیه کننده مفیدی آن باشد از آنج مله آنکه گلسیرین ماده فلورسانت نمی‌باشد، دارای ویسکوزیته مناسب است، همچنین قابل حل در آب و بنابراین قابل شستشو می‌باشد.
