بخشی از مقاله
چکیده
امکان تصویربرداری سه بعدی با تفکیک پذیری قابل قبول از نمونه های درشت مقیاس، موجب شده تا میکروسکوپ لایه نوری1 توجه بسیاری از پژوهشگران را به خود جلب کند. همچنین عدم تزاحم تابش فلورسانی خارج از کانون و سرعت تصویربرداری بالا که موجب پیشگیری از تخریب نوری میشود، از دیگر ویژگیهای بارز این گونه نوین است. در این گزارش ضمن معرفی مزایا وکاربردهای این میکروسکوپ، نحوه چینش میکروسکوپ لایه نوری ایستا را شرح خواهیم داد.
این چیدمان در حالت فلورسانی کارکرده و از آن در تهیه تصاویر سه بعدی از سر و دم نمونه های ماهی قزل الای رنگین کمانی استفاده شده است. با استفاده از این چیدمان موفق به تصویربرداری از نمونه های 2 تا 3 میلی متری با تفکیک پذیری عرضی 1.5 μm و طولی 2.9 μm شده ایم. با استفاده از تصاویر سه بعدی بدست آمده ساختاری کلی استخوان ها در سر و دم ماهی به سادگی قابل مشاهده بوده و قادر به تشخیص دو ساختار استخوانی از دو عمق متفاوت هستیم، که با میکروسکوپهای عادی قابل تشخیص نیست.
مقدمه
تصویربرداری میکروسکوپی از نمونههای زیستی درشت مقیاس که دارای پراکندگی بالا هستند همچون جنین، مغز، تومر، شبکههای عصبی و ... همواره از دغدغههای اصلی زیست پژوهان
است. زیرا که با بزرگتر شدن نمونهها، کیفیت و امکان تصویربرداری از عمق به شدت کاهش یافته و به تبع آن اطلاعات کمتری از عمق نمونه استخراج میشود. همچنین در شیوههای پیشین لایهبندی عموما بهصورت فیزیکی صورت می گرفت. نمونه به برشهای نازک تقسیم میشد، و از کنارهم قراردادن تصاویر دو بعدی این برشها تصویر سهبعدی حاصل می شد.
شیوههای مناسب برای تصویربرداری از محیطهایی با پراکندگی بالا شامل تکنیک تمایز فاز2، مقطعنگاری همدوس نوری[1] 3 مقطعنگاری نوردهی[2] 4 است. هرچند برای بررسی محیطهای درشت مقیاس با پراکندگی بالا شیوههای غیرنوری همچون تصویربرداری فراصوتی5 و مقطعنگاری تشدید مغناطیسی 6 عمق نفوذ بالاتری را فراهم مینمایند، اما همزمان شاهد کاهش تفکیک پذیری نیز خواهیم بود .[3] همچنین از آنجا که این شیوهها برپایه تغییرات موضعی همگن بودن محیط استوارند، انعطاف پذیری و قابلیتهایی که با برچسب زنی در شیوههای فلورسانی وجود دارد، همچون آشکارسازی پروتئینی خاص از طریق برچسب زنی را، ندارند. ضمن آنکه میکروسکوپ لایه نوری در مقایسه با میکروسکوپهای رایج همکانون، دارای سرعت تصویربرداری به مراتب بالاتری هستند.
میکروسکوپ لایه نوری
میکروسکوپی با نوردهی لایهای برای نخستین بار در سال 1903، هنگامی که تابش صفحهای در بررسی محلولهای کلوئیدی مورد استفاده قرار گرفت، مطرح شد. اساس این شیوه بر مبنای لایهبندی نوری با استفاده از سامانه نوردهی صفحهای و عمود بر آشکارسازی استوار است. با هر بار جابهجایی صفحه نوری و نمونه نسبت به یکدیگر، تصویر مربوط به آن صفحه ضبط میشود. از کنار هم قرار دادن تصاویر دو بعدی ضبط شده از لایههای مختلف تصویر سه بعدی نهایی حاصل میشود.
سامانه نوردهی میتواند به دو صورت نوردهی گسترده - ایستا - و یا اسکن کننده خطی7 - پویا - شکل گیرد.[4-6] در نوردهی گسترده تمام صفحه مورد نظر به صورت یکجا نوردهی میشود بدین ترتیب تصویربرداری دارای سرعت بالاتری است. در شیوه نوردهی روبشی خطی، صفحه مورد نظر از طریق روبش کردن آن لایه بهوسیله یک خط نوری شکل میگیرد. تصاویر ایجاد شده با این روش دارای کیفیت بالاتری هستند. همچنین در این شیوه شاهد توزیع شدت یکنواختتری در صفحه ایجاد شده خواهیم بود.
شکل 1 طرح کلی این میکروسکوپها را نشان میدهد که در آن، نوردهی و آشکارسازی از طریق دو عدسیشیئی مجزا و عمود برهم صورت میگیرد. چیدمان میکروسکوپ لایه نوری. نوردهی هم سو با محور x و لایه نوری تشکیل شده در صفحه x-z، و آشکارسازی در امتداد محور y است.8 باریکه سبز رنگ نشان دهنده باریکه لیزر است. ناحیه قرمز رنگ مربوط به تابش فلورسانی بوده و فلشهای قرمز رنگ نور فلورسانی تابشی است.
اسباب و چیدمان آزمایشگاهی
نمونههای مورد بررسی قرار گرفته توسط میکروسکوپ چیده شده، سر ماهی قزلآلا 5 و 10 روزه و دم ماهیهای 28 روزه، با حداکثر طول تصویربرداری شده 3 میلیمتر هستند، که در تمامی آنها برچسبگذاری فلورسانی صورت گرفتهاست . پس از شفاف سازیهای لازم ستون فقرات نمونهها توسط رنگدانه فلورسانی Alizarin Red رنگآمیزی شده است.[7] بدلیل آنکه امکان برانگیختن رنگدانه مورد استفاده در طول موج 532 نانومتر فراهم بود - نور فلورسانی دریافت شده قرمز رنگ است - ، از دیود لیزر سبز رنگ با این طول موج - با توان قابل تنظیم و حداکثر توان خروجی 20 میلی وات - ، در چیدمان استفاده شد.
در این پژوهش از نوردهی ایستا استفاده شده است. برای تولید صفحه نوری مورد نظر پیش از تابش باریکه به عدسی شیئی نوردهی - - Olympus, 10x, NA 0.4، از عدسی استوانهای با فاصله کنونی 15 سانتیمتر استفاده شده است. ضخامت لایه نوری تشکیل شده حدود 10 m است. عدسی شیئی مورد استفاده در بخش آشکارسازی مشابه با عدسی شیئی نوردهی است. نور فلورسانی جمعآوری شده به وسیله عدسی شیئی پس از عبور از فیلتر مناسب، از طریق عدسی تصویرساز به دوربین دیجیتال منتقل میشود. - Point Grey, Grasshopper 3, 1448x1928 - برای جبران کردن شکست نور در اثر عدم هماهنگی میان ضریب شکست ماهی و هوا، نمونهها با PDMS و یا روغن احاطه شدهاند. تفکیکپذیری عرضی حاصل شده در تصاویر حدود 1.5 P ، و تفکیکپذیری طولی در حدود 2.9 m است.
نتایج تجربی
همانطور که پیشتر بیان شد نمونههای مورد بررسی قرارگرفته شامل ماهیهای 5، 10 و 28 روزه هستند. شکل 2 تصاویر سه بعدی ثبت شده از سر ماهی 5 روزه را از چند زاویه متفاوت نشان میدهد. :2 تصاویر سه بعدی ثبت شده از سر هاهی 5 روزه از چند زاویه متفاوت. الف - صفحه x-z9 ب - 45 0 درجه چرخش نسبت به محور z ج - 450 درجه چرخش نسبت به محور x د - صفحه x-y بهمنظور فهم بهتری از مزایای تصاویر گرفته شده به کمک این میکروسکوپ و مقایسه آن با میکروسکوپهای نوری رایج، در شکل 3 تصویر ضبط شده با میکروسکوپ نوری عادی از این نمونه نمایش داده شده است.
