بخشی از مقاله
چکیده
پلی هیدروکسی بوتیرات - PHB - یک پلیهیدروکسی آلکانوات - PHA - است که در باکتري رالستونیا یوتروفا توسط سه آنزیم مسیر بیوسنتزي شامل بتاکتوتیولاز، استو- استیل کوآ-ردوکتاز وابسته به NADPH و PHB سینتاز تولید میشود که این سه آنزیم به ترتیب توسط phbA، phbB و phbC کد میشوند. پلی هیدروکسی بوتیرات بسیار از لحاظ تجاري قابل توجه بوده، زیرا به عنوان ماده پلاستیکی زیستتجزیهپذیر عمل میکند. در این تحققی اُپران سه ژنی PHB با طراحی پرایمر از ژنوم باکتري جداسازي و خالصسازي گردید و پس از کلونسازي صحت جداسازي هر سه ژن با pCR داخلی و واکنشهاي هضم آنزیمی اثبات شد. با کلونسازي ژنهاي مذکور در حامل بیانی باکتریایی و نیز حاملهاي انتقال ژن انتظار میرود بتوان پلیمر پلیهیدروکسی بوتیرات را به صورت مقرون به صرفه به عنوان پلاستیک زیستتخریبپذیر تولید نمود.
کلمات کلیدي: پلاستیک زیستتخریبپذیر، پلیهیدروکسی بوتیرات، کلونسازي.
مقدمه
عدهاي از باکتريها پلیهیدروکسی آلکانوات - PHA - را به عنوان ترکیبات ذخیره انرژي در پاسخ به استرسهاي غذایی اندوخته می کنند. اولین ترکیب از پلیهیدروکسی آلکانواتها، پلیهیدروکسی بوتیرات - PHB - بود که در باکتري باسیلوس مگاتریوم شناخته شد. سالها بعد، مطالعات نشان داد که پلیهیدروکسی آلکانواتها به عنوان پلاستیکهاي تجزیهپذیر زیستی داراي ارزش اقتصادي هستند. پلیهیدروکسی بوتیرات - PHB - یک پلیهیدروکسی آلکانوات - PHA - است که در باکتري آلکالیژنز یوتروفوس توسط سه آنزیم مسیر بیوسنتزي شامل -1 بتاکتوتیولاز -2 استو- استیل کوآ-ردوکتاز وابسته به NADPH و PHB -3 سینتاز تولید میشود که این سه آنزیم به ترتیب توسط phbA، phbB و phbC کد میشوند - اسلاتر و همکاران، . - 1998 دو مولکول استیل-کوآ توسط بتاکتوتیولاز به هم متصل میشوند تا استواستیل کوآ تشکیل شود. استواستیلکوآ توسط استواستیلکوآ-رداکتاز به -3 -R هیدروکسی بوتیرات-کوآ، تبدیل میشود. این ماده ابتدا به صورت منومر فعال است که سپس توسط PHB سینتاز پلیمریزه شده و PHB را تشکیل میدهد - شکل - 1 - سارول و همکاران، . - 2002 هدف از این تحقیق جداسازي و کلونسازي ژنهاي تولیدکننده پلیهیدروکسی بوتیرات بود.
مواد و روشها
ابتدا سوش باکتري Alcaligenes eutrophus از سازمان پژوهش هاي علمی و صنعتی ایران - سایت - PTCC.irost.org تهیه شده و در محیط LB و دماي 28 درجه سانتیگراد کشت گردید و استخراج DNA از این باکتري با استفاده از کیت Qiagen انجام شد.پرایمرهاي اختصاصی براي اپران سه ژنی PHB پس از دریافت توالی آنها از بانک ژن - NCBI - ، با استفاده از نرمافزارOligo Tech طراحی و در نرمافزار Vector NTI مورد آنالیز قرار گرفتند. علاوه بر طراحی یک جفت آغازگر اختصاصی که هر سه ژن phbC، phbA و phbB را در یک واحد با طول 4047bp جدا میکند، دو جفت پرایمر داخلی نیز براي نای اُپران طراحی شد، به طوري که مجموعه سه جفت پرایمر قادر به تکثیر داخلیکل اُپران PHB باشد - شکل . - 1PCR با پرایمر هاي اختصاصی و با استفاده و با استفاده از آنزیم پلیمراز - BioNeer - TLA، که داراي خاصیت تصحیحکنندگی قوي و قادر به تکثیر طول زیاد است، انجام گرفت.
پس از انجام PCR با پرایمرهاي اختصاصی محصولات PCR که باند مورد انتظار 4078bp را براي PHB ظاهر نمود، پس از الکتروفورز روي ژل آگارز، با استفاده از High Pure PCR Product Purification Kit - شرکت - Roche خالصسازي شد و در پلاسمید - Fermentas - pJET1.2 کلونسازي اولیه گردید. پس از انجام واکنش اتصال - Ligation - ، پلاسمیدها، به باکتريهاي مستعد تهیه شده از E. coli تراریزش شده و باکتريها در محیط LB حاوي آمپیسیلین به مدت یک شب در 37°c رشد داده شدند. استخراج پلاسمید از کلونیهاي رشد کرده در محیط مذکور انجام و بررسیهاي لازم به منظور دریافت سه ژن مورد نظر و جهت ورود آنها با استفاده از کلونی PCR، Nested PCR و هضم آنزیمی صورت گرفت. بدینترتیب وکتور نوترکیب موسوم به pJET-PHB، دریافت کننده ژنهاي phbC وphbA و phbB ساخته شد.
نتایج و بحث
ظهور باندهاي مورد انتظار با پرایمرهاي داخلی، صحت طراحی پرایمرهاي اختصاصی را اثبات نمود به طوريکه کل اُپران PHB به صورت سه قطعه مجزا تکثیر گردید. انجام PCR با پرایمرهاي PHB-F و PHB-C2 باند مورد انتظار 967bp را ظاهر نمود. پرایمرهاي PHB-C1 و PHB-AB2 قطعهاي با طول 2173bp نشان دادند و تکثیر با پرایمرهاي PHB-R و PHB-AB1 قطعه مورد انتظار 976bp را ظاهر کردند - شکل . - 2پس از انجام PCR با پرایمرهاي اختصاصی PHB-F و PHB-R طراحیشده براي جداسازي کل اپران PHB، باند مورد انتظار 4078bp ظاهر و پس از خالصسازي در پلاسمید - Fermentas - pJET1.2 کلونسازي اولیه گردید - شکل . - 3 استخراج پلاسمید از کلونیهاي رشد کرده در محیط حاوي آمپیسیلین انجام و بررسیهاي لازم به منظور دریافت سه ژن مورد نظر و جهت ورود آنها با استفاده از کلونی PCR، Nested PCR و هضم آنزیمی صورت گرفت.
ورود گروه ژنی PHB در دو جهت مختلف در وکتور امکانپذیر بود، بدان علت که این ژنها میبایست تحت نواحی تنظیمی پیشبر و پایانبر قرار میگرفتند، لذا جهت صحیح ورود ژن ها در حامل، توسط هضم آنزیمی مورد بررسی قرار گرفت و کلونی حاوي pJET-PHB با جهت صحیح انتخاب گردید.باندهاي مورد انتظار براي گروه ژنی pJET-PHB در هضم آنزیمی مشترك با آنزیمهاي XhoI و XbaI عبارت بود از 4103 و 2949 جفت باز و باندهاي مورد انتظار در هضم آنزیمی مشترك با آنزیمهاي EcoRV و HindIII در صورت ورود PHB در جهت صحیح در حامل pJET عبارت از 4109 و 2943 جفت باز بود - شکل . - 4
