بخشی از مقاله
سنتز، اصلاح سطحی و کاربرد نانوذرات مغناطیسی در تخلیص پروتئینها
چکیده
جداسازی و تخلیص پروتئین هـا در تمـامی زمینـه هـای علـوم زیسـتی و بیوتکنولـوژی کـاربرد گسـترده ای دارد. توسـعه تکنیکهای جدید که بتواند جایگزین روشهای رایج کنونی شود، باعث افزایش بازده و کاهش هزینه های تولید مـی گـردد. جداسازی مغناطیسی یکی از روش های سریع و آسان برای جداسازی پروتئین ها، سلول ها و ملکولهـای مختلـف از میـان نمونه خام اولیه می باشد. حاملها و جاذبهای مغناطیسی در بطن این روش جداسازی قرار دارنـد. بنـابراین در ایـن تحقیـق هدف، مطالعه روش های مختلف سنتز و پوشش دهی ذرات مغناطیسی و کاربرد آن در جداسازی پروتئین ها می باشد.
.1 مقدمه
جداسازی و خالصسازی انواع مختلف پروتئینها، همانند مولکولهای مشخص دیگر، در تمام شاخههای علوم زیستی مورد استفاده قرار میگیرد. توسعه تکنولوژیهای جدید خالص سازی با قابلیت جداسازی مولکول هدف از میان طیف وسیعی از مولکولها در هر دو مقیاس آزمایشگاهی و صنعتی ضروری هستند(.(1
در حوزه بیوتکنولوژی، خالص سازی پروتئینها با روشهایی مانند کروماتوگرافی، الکتروفورز و اولترافیلتراسیون ترسیب انجام میشود که روش کروماتوگرافی تمایلی یکی از مهم ترین روشها است. این تکنیک در حال حاضر قویترین روش موجود در فرآیندهای پاییندستی، به دلیل انتخابپذیری بالا و توانایی بازیابی است. قدرت ستونهای گروماتوگرافی تمایلی در هزاران فرآیند موفق، مخصوصا در مقیاس آزمایشگاهی نشان داده شده است. با این حال از معایب تمام ستونهای کروماتوگرافی مایع، عدم توانایی این ستونها برای خالص سازی در حجم بالا در حضور ذرات بسیار متنوع است. درنتیجه این ستونها برای استفاده در مراحل ابتدایی خالص سازی که ذرات جامد معلق و اجزای رسوب کرده در سیستم حضور دارند، مناسب نیستند. در این زمینه سیستم تمایلی مغناطیسی برای رفع این مشکل بسیار موثر است(.(1 علاوه بر این جداسازی پروتئینها با استفاده از ستونهای کروماتوگرافی بسیار وقت گیر و پرهزینه هستند و تنش بسیار بالایی به پروتئینها وارد میکنند که امکان تخریب مقادیری از آنها و در نهایت کاهش بازده عملیاتی را به دنبال دارد. اما جداسازی با استفاده از ذرات مغناطیسی علاوه بر حذف تنش وارد شده و عدم شکست پروتئینهای بزرگ، باعث کاهش هزینهها و در نتیجه افزایش بازده میشود(.(2
روش جداسازی مغناطیسی یک فرآیند بسیار ساده با یک مرحله عملیاتی است به گونهای که تمام مراحل خالصسازی میتوانند تنها در یک مرحله انجام پذیرند. در بعضی از شرایط حتی امکان پذیر است مراحل شکست سلولی، جداسازی و خالصسازی پروتئینها نیز در یک مرحله انجام شوند و در نتیجه فرآیند خالصسازی کوتاهتر شود و همچنین به دلیل خاصیت مغناطیسی جاذبهای مغناطیسی و غیرمغناطیسی بودن مابقی اجزا، مولکول هدف به راحتی و به نحو انتخاب پذیر از محلول جدا میشود(.(1
.2روشهای تهیه ذرات مغناطیسی
حاملهای مغناطیسی و جاذبها علاوه بر اینکه به صورت تجاری در دسترس هستند، ساخت آنها در آزمایشگاه نیز به راحتی انجام میشود. این حاملها معمولا به صورت ذرات مغناطیسی از جنس پلیمرهای سنتزی، بیوپلیمرها، شیشیه متخلخل یا ذرات مغناطیسی بر پایه مواد مغناطیسی غیرآلی مانند آهن و مس که سطح آن اصلاح شده است، ساخته میشوند.
ذرات با خاصیت سوپرپارامغناطیس در حضور میدان مغناطیسی قوی خاصیت مغناطیسی دارند ولی در عدم حضور آن با هم تعاملی ندارند، به همین دلیل این ذرات در عدم حضور میدان به صورت معلق در محلول به مدت طولانی باقی میمانند. به صورت عمومی ابعاد این ذرات از 50nm تا 10 m متفاوت است. با این حال ذرات مغناطیسی بزرگ تر تا ابعاد میلی متری هم مورد استفاده قرار گرفتهاند. ذرات مغناطیسی با ابعاد بزرگ تر از 1ʽm به راحتی توسط جداکنندههای مغناطیسی جدا میشوند در حالی که ذرات کوچک تر به میدان مغناطیسی بسیار بیشتری احتیاج دارند(.(2
نانوذرات مغناطیسی میتوانند به روشهای فیزیکی، شیمیایی و میکروبی تولید شوند. روشهای فیزیکی مانند رسوب از فازگاز1، لیتوگرافی پرتو الکترونی2 و روشهای شیمیایی شامل سنتز سل-ژل3، اکسیداسیون، ترسیب شیمیایی، واکنشهای گرمابی4 ، سنتز تزریق جریان، سیال فوق بحرانی و غیره هستند.
در جدول 1 هریک از روشهای ذکر شده در بالا به همراه مزایا و معایب آنها آمده است. با اینکه روشهای فیزیکی به راحتی قابل انجام هستند، کنترل اندازه ذرات در این روشها کار سختی است. اما در روشهای سنتز شیمیایی کنترل عوامل تاثیرگذار بر اندازه ذرات راحتتر است(.(3
به طور خاص روش ترسیب شیمیایی نمکهای آهن در محیط آبی آسان ترین و کارآمدترین روش برای سنتز نانوذرات است. برای روش تشکیل نانوذرات مغناطیسی سوپرپارامغناطیس به روش ترسیب نیاز به نسبت مولی 2 به 1 ازFe3+ به Fe2+ است. در حالت کلی این واکنش به صورت زیر در حضور یک باز به عنوان عامل احیاکننده ( عموما محلول آمونیا یا سود) انجام میشود(.(2
باید در نظر داشت که اندازه ذرات و همچنین یکنواختی اندازه آنها با تغییر عواملی مثل میزان نمک مصرفی، میزان باز مصرفی یا قدرت یونی تغییر میکند. شرایط واکنش نیز میتوانند بر روی اندازه نانوذرات تاثیر بگذارند، به عنوان مثال : افزایش شدت همزدگی، یا افزایش دما باعث کاهش اندازه ذرات میشود. تزریق نیتروژن به درون سیستم واکنش علاوه بر جلوگیری کردن از اکسایش بحرانی نانوذرات، منجر به کاهش اندازه ذرات در مقایسه با روشهایی که اکسیژن محیط حذف
نشده اند، میشود
.3اصلاح سطحی نانو ذرات مغناطیسی:
نانوذرات مغناطیسی آهن پوشیده نشده معمولا ناپایدارهستند که باعث کاهش طول عمر این ذرات میشود. بالابودن سطح به حجم این ذرات سبب بالا بودن انرژی سطحی آنها و در نتیجه تمایل به هم چسبیدن و تشکیل ذرات بزرگتر میشود. که نتیجه آن کاهش پراکندگی این ذرات در محلول و رسوب کردن آنهاست.
برای جلوگیری از چنین محدودیتی، راهکارهای مختلفی برای اصلاح سطحی نانوذرات با استفاده از مواد شیمیایی و زیستی در حین و یا بعد از سنتز ارائه شده است.
این روش نه تنها خواص سطحی ذرات از جمله زیست سازگاری، یکنواختی در اندازه ذرات و تجزیه پذیری زیستی آنها را بهبود میبخشد بلکه شرایطی برای انتقال و ماندگاری ذرات آبگریز اکسید آهن در محیط آبدوست را فراهم میکند(.(4 تاکنون مواد مختلفی برای اصلاح سطحی به کارگرفته شدهاند، سورفکتنتهای مانند اولئیک اسید، آلکیل سولفونیک اسید و آلکیل فسفونیک اسید مولکولهای رایجی هستند. پلیمرهایی مانند پلی اتیلن گلایکول (PEG)، پلی وینیل الکل (PVA)، پلی اکریلیک اسید (PAA)، به منظور پوشش دادن سطح نانو ذرات به کارگرفته شدهاند. علاوه بر این مولکولهای طبیعی مانند گلاتین،
دکستران، پلی لاکتیک اسید، آلبومین، کیتوسان نیز بدین منظور مورد استفاده قرار گرفتهاند
شکل -1 ذرات مغناطیسی پوشده شده با A )اولئیک اسید شکل -2 نانو ذرات پوشیده شده با پلیمر (A تک ناحیه (B نوع خوشهای((2 (B نقاط قرمز رنگ بیان کننده گروه کربوکسیلیک اسید((2
سیلان دار کردن سطح نانو ذرات بدون شک پرکاربردترین روش برای عامل دارکردن سطح نانوذرات، به علت سمیت پایین، پایداری بالا تحت شرایط اسیدی، خنثی بودن در واکنشهای کاهشی و ساده بودن اصلاح سطحی شیمیایی ذرات است. واکنش میتواند در یک محیط آبی یا آلی در شرایط دمایی متوسط و بدون تجهیزات گران قیمت انجام گیرد. به همین دلیل به عنوان یک روش ایدهآل برای محافظت از هسته مغناطیسی در نظر گرفته میشود. شکل شماتیک واکنش در شکل 3 نشان داده شده است(.(3
مولکولهای سیلان ابتدا فعال شده ( هیدرولیز) و سپس با واکنش بین گروههای Si-OH سینانول و گروه OH سطح اتفاق میافتد که باعث تشکیل پیوند پایدار بر روی سطح میشود.
نانوذرات مغناطیسی پس از سنتز مورد ارزیابی کامل توسط تکنیکهایی از جمله ردیابی میکروسکوپی الکترون (SEM) برای بررسی شکل ظاهری، میکروسکوپی نیروی اتمی (AFM) برای بررسی سطح ، طیف سنجی مادون قرمز انتقال فوریر (FTIR) برای بررسی گروههای عاملی و دستگاه مغناطیس سنج (VSM) قرار میگیرد.
.4خواص فیزیکی نانوذرات مغناطیسی :
نانوذرات مغناطیسی باید کروی باشند تا خصوصیات هیدرودینامیکی بهتر را به همرا داشته باشند و تمایل کمتری به شکست با توجه به سایش مکانیکی داشته باشند.
دو پارامتر دیگر ابعاد نانوذرات و یکنواخت بودن آنهاست. برای استفاده از نانوذرات در کاربردهای با ظرفیت اتصال بالا، نانوذرات کوچکتر مورد نیاز هستند که هرچه اندازه آنها کوچکتر باشد نسبت سطح به حجم افزایش مییابد.
با توجه به مولکول هدف، پارامتر مهم دیگر تخلخل ذرات است. اگر مولکول هدف کوچک باشد،ذرات غیرمتخلخل برای جلوگیری از نفوذ در سوراخ و محدودیت انتقال جرم ،باید مورد استفاده قرار گیرند(.(5
.5جاذب مغناطیسی ایده آل :
از آنچه در مباحث قبلی مورد بررسی قرار گرفت اکنون میتوانیم خواص جاذب مغناطیسی ایدهآل برای فرآیندهای خالص سازی را برشمرد. به این ترتیب جاذب باید دارای ویژگیهای زیر باشد(:(6
-1 رفتار سوپرپارامغناطیس با حساسیت مغناطیسی بالا
-2 توزیع اندازه باریک و شکل کروی (غیر متخلخل برای پروتئین)
-3 ظرفیت اتصال بالا (برای پروتئین ( 100mg/g<
-4 اتصال غیر اختصاصی پایین
-5 استحکام فیزیکی و شیمیایی بالا
