بخشی از مقاله
چکیده:
براي مطالعه حاضر از ذرات مغناطیس متصل به یون نیکل - Ni2+ - به نام SiMAC beads استفاده شد. این ذرات از شرکت آلمانی Chemicell تهیه گردید. طبق اعلام این شرکت جهت استفاده از این ذرات بایستی از روش ارائه شده توسط Frenzel و همکارانش استفاده میکردیم. اما زمانی که ما از روش Frenzel استفاده کردیم متوجه کمییت و کیفییت بسیار پایین این روش تخلیص شدیم بنابراین راهاندازي روش دیگري که کارایی تخلیص را با این ذرات افزایش دهد مورد هدف ما قرار گرفت. در راستاي این هدف با انجام چندین آزمایش و استفاده از بافرها و محلول هاي متعدد مشخص گردید که بافري با غلظتهاي 50Mm Tris base, 0.5 M Nacl و 1M Imidazole میتواند جهت جداسازي پروتئینهاي هدف با کمترین میزان ناخالصی بکار رود. روش ارائه شده در این مطالعه، بازده تخلیص پروتئینهاي واجد دم هیستیدینی را تا حد قابل قبولی بهبود بخشید.
مواد و روشها:
یک نمونه جدید از ذرات SiMAC از شرکت Chemicell فراهم شد. - 130-042-303 - Magnetic separation stand و یک مگنت - Z304: 135817 - از شرکت پرومگا خریداري شدند. بقیه مواد مورد نیاز نیز از شرکت سیگما خریداري شدند. رشد باکتري ، القاء ، بیان و جداسازي پروتئین نوترکیب: پروتئین نوترکیب ProT در سلول بیانی Rosetta-gami B - DE3 - pLysS بیان شد. براي اینکار این باکتري در محیط LB و دماي 37 درجه سانتی گراد تا زمانی که میزان 2 OD رشد در طول موج 600 نانومتر به حدود 0/5 برسد، کشت داده شد. در این زمان سلولها با 3 IPTG و غلظت نهایی 0.5 mM القاء شده و پس از 4 ساعت کشت اضافی به روي یخ منتقل شدند.
سلولها با استفاده از سانتریفیوژ رسوب داده شدند، به این رسوب 1ml بافر شستشو-اتصال سرد - 20 mM Na2HPO4, pH 7.0 - 4اضافه شد. جهت استخراج پروتئین محلول، سلولها با استفاده از یک دستگاه سونیکاتور sonoplus HD 2070 - برلین، آلمان - براي 5 بار، فواصل 1 دقیقه اي و با قدرت بالا - %70 - پاره شدند. مخلوط حاصل با دور 13000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد، و محلول رویی آن جهت استفاده در روش تخلیص در میکروتیوبهاي جداگانهاي تقسیم و در -20 درجه سانتیگراد نگهداري شد.
روشهاي مورد استفاده براي جداسازي بر اساس ذرات مغناطیس:
جهت دستیابی یک روش بهینه شده تخلیص به روش استفاده از ذرات مغناطیس SiMAC، سه روش مورد استفاده قرار گرفت و از روش Frenzel بعنوان کنترل استفاده گردید. سوسپانسیون ذرات - 100 mg/ml - SiMAC سه بار با 1ml بافر شستشوي ذرات - - 20 mM Na2 HPO4, pH 7.0 شستشو داده شد. سپس از یک روش مشابه جهت آزمایش دو نوع سیستم بافري شامل بافر نمکی فسفات - 5 - PBS و بافر نمکی تریس 6 - TBS - به ترتیب زیر استفاده شد: بعد از دو مرحله شستشو با 500µl بافر شستشوي I حاوي 50 mM NaH2 PO4, 500 mM NaCl و pH 6.0 براي سیستم PBS و 50 mM Tris bas, 500 mM NaCl و , pH6.0 براي سیستم TBS مجدداً عمل شستشو طی 4 مرحله شستشو با بافرهاي شستشوي I، II ،III و IV هر کدام واجد - 50 mM NaH2 0.8 PO4, 500 mM NaCl, pH و به ترتیب با غلظتهاي 25، 50، 100 و 250 میلیمولار ایمدازول براي سیستم PBS و 50 0.8 mM Tris base, 500 mM NaCl, pH و به ترتیب با غلظتهاي 25، 50، 100 و 250 میلیمولار ایمدازول براي سیستم TBS پیگیري شد.
جهت جداشویه و بازیابی پروتئنهاي مورد هدف از 200µl بافر جداشویه 50 mM NaH2 PO4, 500 mM NaCl, 500 mM Imidazole, pH 8.0 براي سیستم PBS و50 mM Tris base, 500 mM NaCl, 500 mM Imidazole, pH 8.0 براي سیستم TBS استفاده شد و این مرحله دو بار تکرار گردید. براساس نتیجه گیري هاي بعمل آمده از دو روش بالا روش سوم دیگري بنیانگذاري شد. این روش با دو مرحله شستشوي مخلوط ذرات مغناطیس و شیره سلولی با بافر شستشوي 50 mM - I - Tris base, 500 mM NaCl, pH 6.0 و پیرو آن سه مرحله شستشو با بافر شستشوي 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 200 mM - II 0.8 - Imidazole, pH آغاز شد و در ادامه نیز جهت جداسازي پروتئینهاي مورد هدف از 200µl محلول جداشویه - 50 mM 0.8 - Tris, 500 mM NaCl, 1M Imidazole, pH استفاده کردیم. ارزیابی روشهاي تخلیص با استفاده از پلی آکریلآمید ژل الکتروفورز:7 جهت ارزیابی در این مطالعه از ژل 12 درصد استفاده شد و بافرها و شرایط مورد استفاده بر اساس کاتالوگ شرکت BioRad انجام شد.
نتایج و بحث:
طبق گزارش Frenzel و همکارانش، پروتئینهاي واجد دم هیستیدین با استفاده از غلظت 250 میلیمولار ایمیدازول از کل شیره سلولی تخلیص شدند. همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است میزان محصول تخلیص شده بسیار کم بوده ضمن اینکه همراه با چندین ناخالصی می باشد. در آزمون هایی انجام شده ما در راستاي بهینه سازي روش تخلیص، در مرحله جداشویی از دو سیستم بافري - سیستمTBS و سیستم - PBS با غلظت 500 میلیمولار ایمیدازول استفاده شد. در این آزمون ها مشاهده شد میزان محصول بازیافت شده در سیستم PBS بیشتر از کار با سیستم TBS است، ولی این میزان بازیافت آنقدر هم زیاد و دلخواه نبود. ضمن اینکه میزان ناخالصی ها هنوز به همان اندازه اي بود که در روش Frenzel مشاهده می شد - تصاویر مربوط به این آزمون ها نشان دادن نشده است - .
بنابراین لازم بود که باز هم روش هاي مناسب تري مورد آزمون قرار گیرند. نتایج حاصل از استفاده از دو سیستم بافري توسط ما و همچنین روش Frenzel و همکارانش - - 3 حاکی از آن است نوع سیستم بافري که در مراحل شستشو و جداشویی استفاده میشود برمیانکنش بین ذراتSiMAC و پروتئینهاي واجد دم هیستیدینی اثر گذار میباشند. میزان محصول بدست آمده در روش تخلیص بهبود یافته توسط ما خیلی بیشتر از روش ارائه شده توسط Frenzel و همکارانش - - 3 می باشد.
بنابراین پیشنهاد می گردد جهت استفاده بهینه از ذرات SiMAC و دستیابی به روش تخلیص با کارایی بالا از بافرهاي و شرایط بهینه شده ما استفاده شود - شکل-. - 2 بر خلاف آنچه که در روش Frenzel و همکارانش آمده ما از غلظت 200 میلی مولار ایمیدازول جهت تهیه بافرهاي شستشو استفاده کردیم و این غلظت از ایمیدازول باعث خروج و اتلاف پروتئینهاي مورد نظر ما در مراحل شستشو نشد - شکل . - 2 بنابراین غلظت 200 میلی مولار ایمیدازول جهت برداشتن ناخالصی ها مناسب گزارش میگردد.
جذب ناخالصیهاي پروتئین به ذرات مورد استفاده در روشهایی که بر اساس metal-ion affinity chromatography استفاده می شود از معضلات بزرگ چنین روش هاي تخلیص می باشد - . - 1 در روش حاضر با استفاده از پروتئین نوترکیب ProT واجد دم هیستیدینی بعنوان یک مدل نشان دادیم که استفاده از غلظت بالاي از ایمیدازول در سیستم بافري تریس - - TBS ضمن کاهش ناخالصهاي تخلیص میزان بازیافت محصول بیش از سه برابر افزایش میدهد.
