بخشی از مقاله
بهینه سازی فرایند تخمیر و تخلیص آنزیم -۲A پروتئینازنوترکیب
بهترین ترکیب محیط کشت برای باکتری [E.coli BLR (DE۳) plySS [PET۲۲b + ۲ APRO شامل g/l ۱۵ عصاره
مخمر، ا/g ۱۰ پپتون و ا/g ۵ کلرید سدیم بدست آمد. سپس سینتیک رشد باکتری و اثر القاء برای تولید آنزیم ۲A- پروتئیناز در فرمانتور همزندار بررسی شد. مشخص شد که القاء کشت با ترکیب IPTO با غلظت ۱ میلی مولار در دانسیته سلولی ۰،۷ = OD۹۰۰nm بهترین شرایط القاء میباشد. در ادامه پس از لیز سلولی و تهیه انکلوژن بادی نسبتا خالص ریفولدینگ و خالص سازی ۲A-پروتئیناز در یک مرحله با استفاده از کروماتوگرافی تغویض یونی Q - سفارز و با خلوص بیش از ۹۵٪ بدست آمد.
واژه های کلیدی: اشرشیاکلی : کروماتوگرافی : تخمیر : A ۲- پروتئیناز
مقدمه: سویه های مختلف اشرشیاکلی (E.Coli) برای تولید انواع پروتئینهای نوترکیب استفاده می شود. یکی از علل استفاده از این باکتری توانایی تولید با دانسیته سلولی بالا و در نتیجه غلظت بالای محصول تولیدی است. علت مهم دیگر این است که این باکتری از نظر ژنتیک، فیزیولوژی و تخمیر یک میکروارگانیسم شناخته شده می باشد و به همین دلایل بعنوان یک میزبان مفید برای تولید بسیاری از پروتئینها استفاده می شود || ۱ | ۲A- پروتئیناز آنزیمی است که نقش کلیدی در عفونت زایی ویروس CVB۳ و تکثیر آن ایفاء می کند. این آنزیم با شکستن فاکتور شروع ترجمه eIF G ، روال عادی سنتز پروتئین سلولی را مختل می کند ۲و۳. تخلیص ۲Aپروتئیناز، امکان طراحی و انجام آزمایشات In Witr0 را جهت درک مکانیسم مولکولی صدمات سلولی در عفونت های ویروسی و نیز درک بهتر ترجمه در فرایند سلول های یوکاریوت مهیا می کند. همچنین با مشخص شدن نحوهٔ عملکرد این آنزیم می توان داروهای ضدویروسی مناسبی را طراحی کرد. در این تحقیق از باکتری E.coli|
حاوی ژن ۲A- پروتئیناز استفاده شده، که این باکتری در مرکز فن آوی زیستی تهیه شده است. بهینه سازی محیط کشت در فرمانتور ناپیوسته، معمولترین و سادهترین روش افزایش بهره دهی کلی تولید پروتئین نوترکیب است. و غالباً می توان با کمک همین محیط کشت بهینه در فرایند تخمیر ناپیوسته مقدار مورد نیاز پروتئین نوترکیب را فراهم کرد، بدون اینکه نیاز به اجرای فرایندهای پیچیدهتر باشد. هرچند فعالیت های اندکی در این رابطه گزارش شده است. کلید توسعه پروسه های میکروبی با باکتری نوترکیب، بهینه سازی بهره دهی کلی فرایند تخمیر (OVerall productivity) ، یعنی نسبت محصول نهایی در واحد حجم به زمان می باشد . برای سویه های E. coli نو ترکيب که پروتئين هاى داخل سلولی توليد میکنند، بهره دهی کلی بالا نیازمند تولید میکروارگانیسم با دانسیته سلولی بالا و بهره دهی ویژه بالا ( Specific Productivity) یعنی نسبت محصول به واحد وزن خشک سلول در حداقل زمان فرایند تخمیر می باشد || ۵ | یکی از فاکتورهای خیلی مهم در بیان پروتئینهای نوترکیب
و افزایش میزان بهره دهی ویژه پروتئین مورد نظر، اثر القاء میباشد. پروتئینهای نوترکیب در سیستم میزبان مختلف نظیر E.coli و یا سایر میکروارگانیسمها می تواند به اشکال متنوعی نظیر پری پلاسمیکٹ، سیتو پلاسمی محلول ، سیتو پلاسمی نامحلول (انکلوژن بادی) و ترشحی محلول تولید شوند که برای هر یک از اینها، استراتژی تخلیص با روشهای بخصوصی انجام می گیرد. بیان بسیار بالای پروتئین نوترکیب در سلول باعث تجمع یافتن آنها بصورت ساختار غیرطبیعی می شود. این ذرات متراکم پروتئینی بصورت انکلوژن بادی هستند و به دلیل خاصیت بازتاب نوری توسط میکروسکوپ نوری قابل مشاهده اند. تمایل به تشکیل انکلوژن بادی در یک پروتئین خاص، هیچگونه ارتباطی با خواص درونی پروتئین نظیر وزن ملکولی، هیدروفو بیسیته، مسیرهای تا خوردگی و نظایر آن ندارد. در عین حال بدلیل تولید بسیار بالای فرم انکلوژن بادی (٪۶۰ پروتئین تام باکتری)، این فرم پروتئین نوترکیب در صنعت مورد توجه قرار گرفته است || ۹ . برای اینکه پروتئین های نوترکیب مورد نظر که ساختار غیرطبیعی دارند (انکلوژن بادی) نهایتاً فعالیت بیولوژیک داشته باشد، بایستی قبل و یا بعد از خالص سازی با روشهای خاصی به فرم طبیعی از نظر ساختمان فضایی برگردد ۹ و۷). روشهایی را که باعث تبدیل انکلوژن بادی از ساختار واسرشته غیرطبیعی به فرم تاخورده صحیح (حاوی فعالیت بیولوژیکی) می شوند، اصطلاحاً ریفولدینگ مینامند.
بنابراین با توجه به اهمیت موارد فوق، اثرات ترکیب محیط کشت و شرایط القاء روی تولید آنزیم ۲A- پروتئیناز نوترکیب در فرمانتور همزندار ناپیوسته مورد بررسی قرار گرفت و پس از بهینه سازی ترکیب محیط کشت و شرایط القاء ریفولدینگ و تخلیص پروتئین مورد نظر با موفقیت به انجام رسید.
مواد و روشها
۱-میکروارگانیسم ارگانیسم استفاده شده در این تحقیق باکتری اشریشیاکلی سویه (BL۲۱ (DE۳ است. باکتری نوترکیب در فریزر C ۷۰ - در ۲۰ درصد حجمی گلیسرول نگهداری می شد. برای کشت اولیه باکتری از محیط کشت پیچیده LB آگار حاوی ۱۰۰ میلی گرم آمپیسیلین استفاده شد. برای تهیه تلقیح، یک کلنی تشکیل شده بر روی محیط کشت فوق به یک ارلن حاوی ۱۰۰ میلی لیتر محیط کشت LB انتقال داده شد و به مدت ۲ ساعت در دمای C ۳۷ روی شیکر با دور rpm ۲۰۰ گرما گذاری شد.
۲- محیط کشت
(Luria Bertany agar). STLB cl-S J2.-- همراه با آمپی سیلین برای کشت باکتری در پلیت استفاده Luria bertany Broth its laela 3-- A.J. (LB) به همراه آمپیسیلین برای تهیه تلقیح استفاده شد. محیط کشت پیچیده شامل: ۱۰g/l پپتون ، ا/۱۵g عصاره مخمر، و ال۵g نمک کلرورسدیم به همراه آمپیسلین به عنوان محیط کشت پایه در فرآیند تخمیر با فرمانتور آزمایشگاهی استفاده شد.
۳- تهیه تلقیح پس از اینکه سویه مورد نظر از بانک سلولی به پلیت حاوی LB آگار و آمپی سیلین انتقال یافت پلیت به مدت ۲ ساعت در انکوباتور با دمای ۳۷C قرار گرفت. یک کلنی بصورت استریل از پلیت به ارلن ۵۰۰ میلی لیتر حاوی ۱۰۰ میلی لیتر محیط کشت LB Broth با آمپیسیلین منتقل شد و پس از ۱۲ ساعت انکوباسیون در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد و ۲۵۰ دور بر دقیقه، به عنوان تلقیح به بیو راکتور ۲ لیتری با حجم کاری یک لیتر تلقیح شد. زمان انکوباسیون تلقیح، طوری است که OD۹..nm مایع تخمیر در فرمانتور پس از انجام تلقیح حداکثر ۱/ باشد. - تخمیر دو بیو راکتور همزن دار آزمایشگاهی (STR) از نوع LabforS با حجم ۲ و ۳/۷ لیتر در این تحقیق مورد استفاده قرار گرفت. در این فرمانتور امکان کنترل اتوماتیک دما، pH ، دور همزن، درصد اکسیژن محلول و کف میسر می باشد. شرایط تخمیر شامل ۲۵۰= دورهمزن ، ٪۳۰= درصد اکسیژن محلول ، ۳۷C= دما و ۷= pH در ابتدای فرایند تخمیر مهیا شد. pH با افزودن سود ۳ نرمال و اسید سولفوریک ۳ نرمال کنترل شد و هوای ۲ اتمسفر با عبور از فیلتر استریل ۰/۲ میکرونی برای فرمانتور مهیا شد.
ہ- آنالیز دانسیته سلولی با اندازه گیری جذب نوری در ۹۰۰ نانومتر به وسیله یک اسپکتروفتومتر UV- Visible اندازه گیری شد. همچنین وزن خشک سلولی با سانتریفوژ نمونه های مایع تخمیر، با دور rpm ۱۰۰۰۰ به مدت ۱۰ دقیقه و خشک کردن رسوب حاصل بدست آمد. همچنین غلظت گلوکز در محیط تخمیر با استفاده از کیت آنزیمی گلوکز اندازه گیری شد. نمونه های پروتئین بوسیله الکتروفورز روی ژل SDS-PAGE شامل ۱۲/۵ درصد پلی اکریل آمید، جدا سازی شد، ژل بوسیله معرف کوماسی بلو (۲۵۰-R) رنگ آمیزی شد. سپس باندهای پروتئین روی ژل - SDSPAGE به روش دانسیتو متری اندازه گیری شد.
۱- برداشت سلول سلولهای اشرشیاکلی نوترکیب پس از کشت در فرمانتور توسط سانتریفوژ با دور TDI11 ۵۰۰۰ برداشت شد. پس از دور ریختن سوپر ناتانت، رسوب سلولی برای مراحل بعدی مورد استفاده قرار گرفت.
۷- لیز سلولی و تهیه انکلوژن بادی ۱۵ گرم سلول E.coli (وزن تر) در بافر A حاوی ترکیبات سپس شکست سلولی با استفاده از هموژنایزر فشار بالا (فشار Bar ۱۵۰۰) با بازده بالا انجام گرفت. رسوب انکلوژن بادی پس از سانتریفوژ (C" ؛ ، ۲۰، rpm ۱۲۰۰۰) و انجام دومرحله شستشو با بافر B (حاوی بافر A بعلاوه Sarkosyl ۱٪) و بافر C (حاوی بافر A بعلاوه ۳MUrea
)، در نهایت در بافر A+ ۷M Urea) D) حل گردید.
۸- ریفولدینگت و تخلیص روشهای ریفولدینگ ۲A- پروتئیناز نوترکیب با سه استراتژی مختلف انجام گرفت. الف- قبل از کروماتوگرافی تعویض یونی Q - سفاروز به روش شیب غلظت اوره با استفاده از کیسه دیالیز و نیز روش رقیق سازی. ب - همزمان با خالص سازی در ستون تعویض یونی Qسفاروز ج- بعد از مرحله تخلیص با ستون ()- سفاروز به روش رقیق
سازی انجام گرفت.
۹-- آنالیز A ۲- پروتئیناز نوترکیب خلوص و شناسایی ۲A- پروتئیناز به ترتیب با روش الکتروفورز SDS-PAGE و وسترن بلات با آنتی بادی پلی کلونال ضدویروس CVB۳ و آنتی بادی ضد ۲Aپروتئیناز بررسی شد.
