بخشی از مقاله
چکیده:
در چند سال گذشته تلاش براي جداسازي ویروس انفلوآنزاي اسب با موفقیت محدودي همراه بوده است در حالی که شناسایی سریع انفلوآنزاي اسب براي کنترل بیماري ضروري است. به منظور استفاده از یک روش سریع, قابل اعتماد و حساس براي شناسایی ویروس انفلوآنزا در اسب به عنوان جایگزین براي جداسازي ویروس, یک روش - nPCR - nested PCR بهینه سازي گردید. این آزمایش nPCR بدون توجه به تیپ و تحت تیپ می تواند ژنوم ویروس هاي انفلوآنزايA را شناسایی نماید. در این مطالعه تحت تیپ-1 ویروس انفلوآنزاي اسب آزمایش شد و با استفاده از پرایمرهایی که پیشتر گزارش شده بود قطعه اي به طول 244 bp از ناحیه conserve ژن ماتریکس ویروس انفلوآنزا تکثیر شد.
در قدم بعدي براي افزایش حساسیت آزمایش اول, یک جفت پرایمر داخلی جدید طراحی شد. یک قطعه 150 bp در آزمایش nPCR بدست آمد. ویژگی نتایج بوسیله تعیین توالی محصول PCR مورد تائید قرار گرفت. این روش سریع تشخیص مولکولی که بسیار حساس نیز هست می تواند ویروس انفلوآنزا را درمدت کوتاهی شناسائی نماید. بنابر این می تواند در تشخیص زودهنگام همه گیري هاي مشکوك به انفلوآنزاي اسب ارزشمند باشد. یک مزیت اضافی این روش ارزش آن در شناسایی ویروس انفلوآنزاي تیپ A در دیگر گونه هاي حیوانی می باشد.
واژه هاي کلیدي: ویروس انفلوآنزاي اسب، RT-PCR ، ,nPCR تشخیص.
مقدمه:
انفلوآنزاي اسب یک بیماري تنفسی حاد و واگیردار اسب است. ویروس انفلوآنزاي اسب به خانواده ارتومیکسوویریده تعلق دارد و داراي دو تحت تیپ مجزاي A/equi-1 - H7N7 - و A/equi-2 - H3N8 - می باشد. بیماري انفلوآنزاي اسب دریک جمعیت حساس به سرعت انتشار می یابد . - 3 - جداسازي ویروس زمان بر است و به امکانات ویژه نیار دارد . - 4 - اخیرا استفاده از روش هاي ELISA - براي شناسایی پادگن هاي ویروس - و RT-PCR نتایج سریع تري به همراه داشته است . - 5 - انتقال بین گونه اي ویروس هاي انفلوآنزا به اثبات رسیده است . - 3 - بر این پایه, واکنش هاي PCR در دو مرحله طراحی می شوند.
واکنش اول به طور عمومی و با استفاده از پرایمرهایی انجام شود که بتواند ویروس هاي انفلوآنزاي همه گونه ها راشناسایی نماید و در واکنش دوم تعیین تیپ ویروس گونه مورد نظر انجام شود . - 4 - فوشیر و همکاران - 2000 - بر اساسناحیه بسیار مشترك ژن ماتریکس یک جفت پرایمر براي آزمایش RT-PCR معرفی نمودند که واکنشی سریع, حساس و اختصاصی براي شناسایی تمام واریانت هاي ژنتیکی و آنتی ژنیکی ویروس هاي انفلوآنزاي A است . - 2 - در پژوهش حاضر مرحله اول آزمایش RT-PCR با به کارگیري پرایمرهاي طراحی شده توسط فوشیر و همکاران و استفاده از ژنوم ویروس انفلوآنزاي اسب بهینه سازي و تعیین حساسیت شد و در ادامه براي افزایش حساسیت واکنش, یک جفت پرایمر داخلی جدید طراحی و آزمایش - nPCR - nested-PCR بهینه سازي گردید.
مواد و روش کار: ژنوم تحت تیپ - H7N7 - 1- ویروس انفلوآنزاي اسب با استفاده از کیت ,Invitrogen - TRIZOLآمریکا - استخراج شد و براي بهینه سازي واکنش مورد استفاده قرار گرفت. واکنش RT به مدت یک ساعت در 37 درجه سانتیگراد انجام شد. سپس نمونه بلافاصله براي واکنش PCR مورد استفاده قرار گرفت. پرایمرهاي رفت و برگشت مورد استفاده در واکنش RT-PCR به ترتیب M52C و M253R بودند . - 2 - این پرایمرها از ژن ماتریکس ویروس انتخاب شده اند که ردیف آن ها در ویروس هاي انفلوآنزا براي تمام گونه هاي حیوانی مشترك می باشد. بدیهی است با این واکنشویروس انفلوآنزاي اسب و واریانت هاي آن نیز قابل شناسائی هستند. واکنش PCR با استفاده از برنامه حرارتی زیر انجام شد: ْ
به مدت دقیقه - یک چرخه - و سپس با چرخه حرارتی به صورت ْ به مدت یک دقیقه،به مدت یک دقیقه و ْ به مدت یک دقیقه و در پایان ْ به مدت دقیقه منظور گردید.به منظور افزایش حساسیت آزمایش ,PCR آزمایش nPCR بهینه سازي گردید. بدین منظور بر اساس توالی ژنوم ویروس یک جفت پرایمر داخلی جدید طراحی گردید. نام و توالی پرایمرهاي طراحی شده در این پژوهش 5’-می باشد. آزمایش nPCRC به مدت 4 C به مدت 30C با برنامه حرارتیْ94 دقیقه - یک چرخه - و سپسْ94 ثانیه، ْ55 به مدت30 ثانیه و ْ72 به مدت30 ثانیه 30 - چرخه - و در نهایتْ72 به مدت 10 دقیقه - یک چرخه - انجام گردید.
نتایج: با توجه به پرایمرهاي مورد استفاده در آزمایش هاي RT-PCR و nPCR باند هاي مورد انتظار قطعاتی 244 و 150جفت بازي بودند - شکل شماره . - 1 مقایسه توالی بدست آمده از واکنش RT-PCR - داده ها نشان داده نشده است - با توالی هاي موجود در بانک ژن - BLAST - درستی و اختصاصی بودن آزمایش انجام شده را به اثبات رسانید.
بحث:
در دسترس بودن یک روش تشخیصی حساس براي شناسایی سریع و اقدامات کنترلی در هنگام بروز همه گیري هاي انفجاري انفلوآنزا غیرقابل اجتناب است. بعلاوه در اسب هاي داراي ایمنی نسبی مقادیر اندکی ویروس در مدت زمان کوتاهی دفع می شود که اغلب نیاز به تکرار کشت است و طولانی شدن زمان تشخیص را به دنبال دارد . - 5 ,3 - روش هاي ELISAبراي شناسایی مستقیم پادگن هاي ویروسی نیز از خود حساسیت متغیري نشان می دهند . - 5 - دونفورینو و همکاران - 1994 - براي اولین بار نشان دادند که می توان روش RT-PCR را براي شناسایی ویروس انفلوآنزاي اسب مورد استفاده قرار داد. درپژوهش حاضر یک واکنش nPCR براي استفاده در آزمایشگاه هاي تشخیصی بهینه سازي شد.
چندین دیدگاه این روش راقابل استفاده می سازد. اول, این که روش سریعی است که در مدت یک روز کاري به نتیجه می رسد. دوم, امکان شناساییهمه تحت تیپ هاي ویروس انفلوآنزاي A را فراهم می سازد. بعلاوه, ویروس هاي انفلوآنزاي تیپ A توان بالقوه اي براي زئونوز بودن را دارا هستند . - 5 ,2 - بنابر این استفاده از این پرایمرها در آزمایشگاه هاي مراکز تشخیص دامپزشکی نه تنها باعث افزایش قابلیت آن ها می شود, بلکه به عنوان یک مزیت اضافی در بهداشت عمومی نیز محسوب می گردد. سوم, بدون حضور ویروس قابل کشت در نمونه هاي بالینی هم امکان تشخیص و شناسایی ویروس را در نمونه هایی که ممکن است توان رشد در محیط کشت را از دست داده باشند براي آزمایشگاه فراهم می سازد. نتایج این پژوهش نشان می دهد که شناسایی ژنوم ویروس انفلوآنزا با حساسیت بسیار زیادي صورت می پذیرد. براي کامل شدن فرایند تشخیص, بهینه سازي واکنش دیگري با استفاده از پرایمرهاي اختصاصی براي شناسایی تحت تیپ هاي هر گونه را پیشنهاد می نماید.
منابع:
