بخشی از مقاله
چکیده
نیشکر با نام علمی Saccharum officinarum L. یکی از محصولات مهم کشاورزی کشور در استان خوزستان میباشد که دارای اهمیت مهم از منظر اقت صادی و محیط زی ست ا ست. متا سفانه هر ساله این مح صول در معرض سرمازدگی قرار گرفته، هرچرند استان خوزستان دارای آب و هوای گرم می باشد اما سالیانه خسارات زیاد ب دلیل سرمازدگی به این محصول متحمل می گردد. از این رو بررسی و شناسایی باکتریهای همزیست با این نیشکر و خصوصا با توجه به نقش باکتری های دارای پتانسیل تشکیل هسته در سرمازدگی گیاهان حائز اهمیت است.این پژوهش برای اولین بار تا کنون بر روی گیاه نیشکر انجام پذیرفته است.
پس از نمونه برداری از این محصول و جداسازی باکتریهای اپیفیت موجود و انجام آزمونهای بیوشیمیایی، فنوتیپی و مولکولی بیشترین فراوانی استرینهای باکتریایی مربوط به چهار استرین Pseudomonas fluorescenceKSK1، Xanthomonas sp.KSK2، Erwinia sp.KSK3 به عنوان استرین های گرم منفی و جنس Bacillus sp.KSK4 به عنوان جنس گرم مثبت بود. از بعد از سنجش توانایی فعالیت ه سته یخ از چهار ا سترین شناسایی شده دو استرین Pseudomonas fluorescence KSK1، Xanthomonas sp. KSK2 توانایی تولید هسته یخ را دارا بودند.
مقدمه
نیشکر با نام علمی Saccharum officinarum L. گیاهی از خانواده غلات - - Poaceae یک محصول استراتژیک و اصلی در استان خوزستان می باشد که در سطوح بسیار کلان کشت آن صورت می پذیرد. در ایران تقریبا 60 درصد قند و شکر تولیدی از نیشکر و بقیه از چغندر قند تولید میشود - . - 1 در ایران در زمان ناصرالدین شاه با کوشش امیر کبیر قلمه هایی از هندوستان جهت کشت در مازندران و خوزستان وارد گردید اما این کار رونقی نیافت.
در سال 1331 بنا به دعوت سازمان فائو، توسط کارشناسان سازمان فائو از ایران بازدید به عمل آمد و گزارشی تهیه گردید تا در سال 1336 دوازده هزار هکتار از زمین های هفت تپه زیر کشت نیشکر قرار گرفت و در سال 1340 اولین بهره برداری از کارخانه شکر با ظرفیت پنجاه هزار تن در سال، و بعدها صد هزار تن در سال صورت گرفت - . - 2 با توجه به آلودگی های صنعتی و ریزگردهایی که استان خوزستان را تهدید می نماید و همچنین به مخاطره افتادن تالاب ها، کشت و صنعت های نیشکر استان خوزستان که سرتاسر اطراف شهر اهواز را احاطه کرده اند در سالم سازی محیط نقش دارند - . - 3 علاوه بر این نقش این کشت و صنعت ها را در بقای حیوانات و پرندگانی که در این زیست بوم های زندگی می کنند را نمیتوان نادیده گرفت.
از این رو بررسی فون میکروبی میکروب های همزیست با این محصول می تواند حائز اهمیت باشد. به غیر از عوامل محیطی و حساسیت گیاهان به نوسان دمایی به نظر می رسد عوامل دیگری با نام عوامل مولد هسته یخ نیز در یخ زدگی گیاهان دخالت دارند . این عوامل را میتوان به دو دسته عوامل مولد هسته یخ با منشاء بیولوژیک موثر در یخ زدگی و همچنین عوامل با منشاء غیر بیولوژیک موثر در این فرآیند اشاره کرد.[4] برخی باکتریها دارای پروتئینهایی در روی غشاء سلولی خود دارند که این این خاصیت را به باکتریها میدهند که در دماهای بالاتر از منفی 1 درجه سانتی گراد موجب یخ زدگی در محیط اطراف خود شوند.
از این باکتریها می توان به برخی از جنسهای Pseudomonas spp.، Xanthomonas spp.،.Erwinia spp و Pantoea spp. که توانایی تولید و وجود پروتئینهای مولد هسته یخ در آنها شناسایی شده اشاره کرد - - 4، . - 5 - تولید پروتئینهای هسته یخ به نظر میرسد یک توانایی منحصر به فرد از باکتریهایی می باشد که در سطوح گیاهی هستند، این باکتریها به آسانی توسط جریان باد در نواحی رویی مزارع و باغات و در اتمسفر منتشر میشوند - . - 6 باکتریهای اپیفیت نقش قابل توجهی در فعالیتهای گیاهان دارند که میتوانند بیمارگر باشند یا اختلالات فیزیولوژیکی نظیر سرمازدگی را تشدید ورزند. برخی از این میکروارگانیسم های اپیفیت پاتوژن گیاهی هستند ولی تعدادی نیز با اینکه در سطوح برگها و دیگر قسمت های گیاهی استقرار یافته اند فاقد بیماریزایی می باشند - . - 7
به طور کلی، تقریبا باکتریهای اپیفیت به جایی که اقامت دارند خسارت نمی زنند، اما در برخی موارد میتوانند مضر و یا مفید باشند. یک مورد بارز در مورد این باکتریها ترویج تشکیل کریستالهای یخ میباشد که همان سایتهای هسته یخ میباشند. گونه های خاصی از اپیفیت های رایج از قبیل Pseudomonas fluorescens، Erwinia herbicola، Xanthomonas spp. و همچنین پاتوارهایی از Pseudomonas syringae توانایی ایجاد هسته یخ را دارا میباشند. تعداد دیگری از باکتریها از قبیل Bacillus، 22 درصد و به تعداد کمتری از باکتریهای Serratia، Acinetobacter، Corynebacterium و Lactobacillusنیز این توانایی گزارش شده است - . - 8
والی و همکاران در سال 1976 بر روی عوامل زنده دخیل در یخ زدگی گیاهان بررسی هایی انجام دادند و باکتری Pseudomonas syringae را شناسایی کردند. در سال 1976 آرنی، لیندو و آپر در مزارع دانشگاه ویسکانسین خسارت سرمازدگی در ذرت Zea myse L. را نشان دادند. شناسایی عوامل هسته یخ در سایر علوم نیز مورد بررسی قرار گرفت و کارهایی همانند تولید برف مصنوعی، از بین بردن حشرات فعال در زمستان، صنایع بستنی، بکارگیری در مواد غذایی که نیاز به یخ زدن دارند - . - 9 با توجه به اینکه اطلاعاتی در ارتباط با عوامل تشدید کننده سرمازدگی از جمله باکتریهای مولد هسته یخ بر روی میزبان گیاهی نیشکر وجود ندارد لذا این تحقیق به منظور شناسایی باکتریهای مولد هسته یخ در استان خوزستان انجام گرفت.
مواد و روشها
جداسازی
در تابستان 1393 نمونه برداری بصورت تصادفی از کشت و صنعت نیشکر امیر کبیر بصورت حرکت در قطر مزارع انجام پذیرفت. نمونه ها شامل برگهای شاداب و فاقد هر گونه لکه و بیماری بودند. سپس جهت جداسازی باکتریهای هدف نمونهها به آزمایشگاه انتقال داده شدند. به میزان 50 گرم از برگهای نمونه برداری شده بصورت سالم درون ارلن حاوی 100 میلی لیتر محلول آب مقطر استریل و یک گرم ژلاتین قرار داده و به مدت زمان 30 دقیقه روی شیکر با دور 120 دور در دقیقه قرار داده شدند.
از سوسپانسیون حاصل سری رقت هایی تا 103- تهیه گردید و از هر نمونه دو یا سه لوپ به صورت خطی بر روی محیط کشت آگار مغذی1 حاوی عصاره مخمر و پپتون کشت گردیدند. نمونه ها به دمای 26 درجه انکوباتور برای مدت سه روز منتقل شدند. پس از سه روز کلونیهای باکتریایی رشد کرده دارای تنوع مناسب که دارای فاصله از سایر کلنیها بودند بصورت چمنی در محیط کشتهای جدید جهت خالص سازی و نگهداری کشت گردیدند. مجموعا 90 ایزوله دارای تنوع در رنگ و شکل کلنیها انتخاب و خالص سازی گردیدند.
الکتروفورز پروتئینهای سلولی
جهت سهولت در انجام آزمونهای باکتری شناسی با استفاده از انتخاب الگوی پروتئینی مشابه بین ایزوله ها تعیین نمایند به روش SDS-PAGE روش ناپیوسته لاملی صورت گرفت - . - 10 آزمون هسته یخ آزمون فعالیت هسته یخ به روش لیندو، 1983 انجام پذیرفت. در این آزمون ابتدا حمام اتانول در دماهای -2 تا -8 درجه سانتی گراد تهیه گردید. برای مشاهده عمل یخ زدگی توسط استرینهای باکتریایی ابتدا فویلهای آلومینیومی به شکل قایق درآمد و روی آن با وازلین به صورت یکنواخت پوشیده شد جهت یکنواخت شدن وازلین فویلهای آلومینی در دمای 50 درجه سانتی گراد به مدت 3 دقیقه قرار گرفتند. از استرینهای نماینده سری رقت هایی با OD=0.1 در طول موج 600 نانومتر تهیه گردید.
چرخههای حرارتی شامل واسرشته سازی اولیه در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه و 35 چرخه شامل واسرشته سازی در دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 90 ثانیه، اتصال در دمای 61 درجه سانتیگراد به مدت 90 ثانیه و اتساع در 72 درجه سانتیگراد به مدت 3 دقیقه بود که با یک مرحله اتساع نهایی در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه خاتمه یافت. برای اطمینان از اندازه صحیح قطعه تکثیرشده از الکترفورز در ژل آگارز یک درصد استفاده شد.
