بخشی از مقاله
چکیده
اسانس های گیاهی در صنایع غذایی کاربرد فراوانی دارند و دارای خاصیت ضد میکروبی بر طیف وسیعی از میکروارگانیزم ها می باشند. بدین منظور در این تحقیق اثر ضد میکروبی اسانس گیاه داروی مریم نخودی در شرایط آزمایشگاهی بر روی مخمر مورد مطالعه قرار گرفت. بعد از جمع آوری سرشاخه های گلدار گیاه مورد نظر جهت شناسایی ترکیبات اسانس از دستگاه GC/MS استفاده شد. همچنین جهت بررسی اثر ضد میکروبی اساانس، از غلظتهای مختلف اسانس - 2، 1، 0/75، 0/5و 0/250 درصد - به محیط کشت YM Agar اضافه گردید و رشد و عدم رشد مخمر در این شرایط مورد بررسی قرار گرفت.
آنالیز با دستگاه گروماتوگرافی، 25 ترکیب را برای اسانس جداسازی و شناسایی کرد که از بین آنها ترکیبات بتا پینن 7/87 - درصد - ، کارواکرول 6/41 - درصد - ، بتاکاریوفیلن 19/30 - درصد - ، فارنسیس سیس بی 7/40 - درصد - ، بیساکوجرماکرون 4/99 - درصد - ترکیبات غالب را داشتند. حداقل غلظت بازدارندگی اسانس مریم نخودی در محیط کشت مخمر کلویورومایسس مارکسیانوس 0/5 درصد بود. بطور کلی میتوان اینطور برداشت کرد که گیاه مریم نخودی به علت دارا بودن ترکیبات ترپنی دارای اثر بازدارندگی بر مخمر کلویورومایسس مارکسیانوس می باشد.
مقدمه
اسانسهای گیاهی که به عنوان ترکیبات طبیعی شناخته می شوند، بطور گستردهای در صنایع غذایی استفاده شده و دارای خاصیت ضد میکروبی بر طیف وسیعی از میکروارگانیزم ها می باشند - شافعی و همکاران، . - 1389 مریم نخودی - Teucrium - polium متعلق به تیره نعناعیان است که دارای خواص ضد میکروبی، ضد اسهال، ضد درد، کاهنده چربی و قند خون می باشد. این گیاه دارویی با ارزش پراکندکی وسیعی در نقاط مختلفی از ایران از جمله شمال، غرب، جنوب، مرکز و غالب نواحی بایر و کوهستان های نیمه خشک دارد .[1]
مخمر کلویورومایسس مارکسیانوس یکی از عوامل آلوده کننده و مولد فساد در برخی از مواد غذایی از جمله ماست و فرآورده های وابسته به آن، مانند نوشیدنی دوغ در ایران می باشد - Viljoen et al., 2003 - و می تواند سبب بادکردگی بسته بندی ناشی از تولید دوغ گردد. لذا بررسی اثر ضد میکروبی اسانس گیاه کاکوتی بر روی این مخمر می تواند گاهی سودمند جهت دستیابی به روشهای جدید ایمن سازی مواد غذایی با استفاده از ترکیبات نگهدارنده طبیعی باشد.
در یک مطالعه محققان نشان دادند که اثرات ضد میکروبی اسانس ها نعناع و پونه و گلاب را بر روی دباریومایسس هانسنی در دوغ ایرانی در دماهای 4 و 25 درجه سانتی گراد در یک دوره زمانی 48 روزه مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج نشان دادند که همه غلظت های اسانس های نعناع و پونه در دمای 25 درجه سانتی گراد اثر مشخص و معنی داری در کاهش لگاریتم تعداد مخمر داشته و در دمای 4 درجه سانتیگراد فقط غلظت های 1/5، 1، 0/5، 0/25 درصد اسانس نعناع و غلظتهای 1/5، 1، 0/5 درصد اسانس پونه باعث کاهش لگاریتم تعداد مخمر بطور معنی داری می شوند .[2] شافعی و همکاران در سال 1389 نشان دادند که تعداد استرپتوکوکوس ترموفیلوس و لاکتوباسیلوس بولگاریکوس در نمونه های ایران - دوغ محلی - تولید شده با ادویههای نعناع، آویشن و سیر و نمونه شاهد در طول نگهداری بصورت معنا داری کاهش می یابد.
هرچند استفاده از گیاهان تیره نعناع به عنوان چاشنی در غذاهای مختلف و همچنین در معالجه بسیاری از بیماریها از دیر باز در ایران موسوم بوده و برای مثال می توان به استفاده از گیاه مریم نخودی در نوشیدنی دوغ اشاره کرد ولی مطالعه و تحقیقی بر روی اثر این گیاه بر مخمر عامل فساد این فرآورده یعنی مخمر کلویورومایسس مارکسیانوس صورت نگرفته است، لذا این پژوهش با هدف بررسی اثر اسانس گیاه مریم نخودی بر روی مخمر کلویورومایسس مارکسیانوس انجام گردید.
مواد و روش ها
تهیه گیاه : گیاه مریم نخودی به مقدار مورد نیاز از کوهستانهای شهرستان سپیدان جمع آوری شد. برای تهیه سوسپانسیون میکروبی، مخمر Kluyveromyces marxianus - PTCC 5193 - از سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران تهیه گردید. همچنین برای تهیه سوسپانسیون میکروبی، مخمر لیوفیلیزه در 20 ml محیط کشت YM broth حل شد و در انکوباتور در دمای 24 درجه به مدت 48 ساعت قرار داده شد. ترکیب شیمیایی محیط کشت - YM - عبارتند از - گرم به ازاء لیتر - : گلوکز 10، عصاره مخمر 3، پپتون سویا 5، عصاره مالت .3 پس از طی 48 ساعت شمارش میکروبی انجام شد. جهت پی بردن به جمعیت میکروبی، با تهیه رقت های مورد نیاز از روش پور پلیت استفاده شد.
سوسپانسیون یک کشت خطی جهت اطمینان از عدم آلودگی تهیه شد . سوسپانسیون را در دمای 4 درجه سانتی گراد قرار داده و جهت کشت مجدد در فواصل دو هفته استفاده شد. همچنین برای تعیین غلظت مهاری - MIC - از غلظتهای 2، 1، 0/75، 0/5و 0/250 درصد اسانس و روش لکه گذاری استفاده شد. بدین صورت که در هر پلیت 14سی سی از محیط کشت آگار YM به همراه درصد مورد نظر اسانس و حلال DMSO ریخته شد. لکه گذاری بصورت مضاعف بر روی پلیت ها انجام گرفت. هرلکه 3 میکرولیتر و حاوی CFU/ml 106 از مخمر بود. سپس پلیتها به گرمخانه 24 درجه سانتی گراد منتقل شد و بعد از 48 ساعت برای رشد میکروبی مورد بررسی قرار گرفت.
نمونه برداری از گیاهان در اواسط خرداد ماه - مرحله گلدهی کامل - انجام شد. پس از برداشت نمونهها در سایه خشک شدند و وزن خشک آنها بر حسب گرم در بوته محاسبه شد. از پودر تهیه شده حاصل از آسیاب نمودن بیوماس - اندام هوایی - خشک شده. از هر نمونه خشک شده 100 گرم آسیاب گردید و به مدت چهار ساعت با استفاده از روش تقطیر با آب، اسانس گیری و درصد آن تعیین شد. ترکیب های تشکیل دهنده اسانس توسط دستگاه کروماتوگرافی گاز - GC - - کروماتوگرافی گازی مدل شیماتزو - Shimatzu - مجهز به دتکتور F.I.D - یونیزاسیون شعله هیدروژن - و داده پرداز Chromatepac، ستون DB-5 و نیمه قطبی به طول 30 متر، قطر داخلی 25 میکرون و ضخامت لایه فاز ساکن برابر 0/25 میکرون، گاز حامل هلیوم، سرعت جریان گاز حامل 22/7 سانتی متر بر ثانیه، برنامه حرارتی 50-250 درجه سانتی گراد با سرعت 4 درجه سانتی گراد بر دقیقه و دمای محفظه تزریق 260 درجه سانتی گراد بود.
کروماتوگرافی گازی مجهز به طیف سنج جرمی - GC/MS - - کروماتوگرافی گازی Varin-3400 متصل شده با طیف سنج جرمی - Saturn II - ، ستون DB-5 و نیمه قطبی به طول 30 متر، قطر داخلی 25 میکرون و ضخامت لایه فاز ساکن برابر 0/25 میکرون، دتکتور Ion trap، گاز حامل هلیوم، سرعت جریان گاز حامل 35 میلی لیتر بر دقیقه و انرژی یونیزاسیون در طیف سنج جرمی معادل 70 الکترون وات، برنامه حرارتی 60-240 درجه سانتی گراد با سرعت 3 درجه سانتی گراد بر دقیقه و دمای محفظه تزریق 220 درجه سانتی گراد بود. - واقع در مؤسسه تحقیقات جنگل ها و مراتع کشور تجزیه شد. پس از تزریق اسانس به دستگاههای نامبرده، با استفاده از زمان بازداری ترکیبها - tR - ، اندیس بازداری - RT - طیف جرمی و مقایسه این پارامترها با ترکیبهای استاندارد و با اطلاعات موجود در کتابخانه نسبت به شناسایی ترکیبهای تشکیل دهنده اسانس اقدام گردید. درصد کمّی این ترکیبها نیز با محاسبه سطوح زیر منحنی در کروماتوگرامها محاسبه شد .[3]
نتایج و بحث
مشاهده پلیتهای مربوط به درصدهای مختلف اساس به کار رفته نشان داد که بیشترین رشد مخمر مربوط به تیمار 0/25 درصد اسانس بود در حالیکه در سایر پلیت ها هیچ گونه رشدی مشاهده نشد. با توجه به نتایج حداقل غلظت مهاری اسانس مریم نخودی برای مخمر کلویورمایسس مارکسیانوس 0/5 درصد اسانس می باشد. فعالیت بیولوژیک و کاربرد اسانس در صنایع مختلف بستگی به ترکیبات شیمیایی موجود در آن دارد، که خود تحت تأثیر عوامل محیطی، مرحله رشد، زمان برداشت و اندام مورد استفاده قرار میگیرد. نتایج به دست آمده از این تحقیق نشان می دهد که گیاه مریم نخودی دارای اثر بازدارندگی بر روی مخمر کلویورمایسس مارکسیانوس می باشد. از آنجایی که ترکیبات ضد میکروبی روغنها در حقیقت فنولیکها و ترپنها هستند، به نظر می رسد که نحوه مکانیسم اثر ضد میکروبی آنها مشابه دیگر ترکیبات ترپنی باشد.
ترکیبات عمده اسانس مورد مطالعه در این تحقیق مونوترپنها می باشند - جدول . - 1 ترپن ها قادرهستند که به غشاء سلولی صدمه بزنند و در ساختار لیپید دیواره سلولی باکتریها نفوذ کنند که این امر منجر به دناتوراسیون پروتئینها و از هم پاشیدن ساختار سلولی و تراوش سیتوپلاسم و در نهایت مرگ سلول میشوند . - Oussalah et al., 2006 - آلفا-پینن و بتا-پینن که از ترکیبهای اصلی گیاه مورد بررسی میباشند، شناختهترین ترپنها بوده که اثرات ضد باکتریایی این دو ترکیب به اثبات رسیده است . - Afolayan et al., 2009 -
