بخشی از مقاله
چکیده
طی بازدیدهاي به عمل آمده از 30 گلخانه در غرب مازندران بین سالهاي 87-89، نمونه هاي مشکوك به پوسیدگی نرم از اندامهاي ریشه، ساقه و برگ در گلهاي زینتی چون اگلونما، سینگونیوم، حسن یوسف، دیفن باخیا، سیکاس، بگونیا و پتوس جمع آوري شد. بعد از کشت نمونه ها روي محیط کشت هاي KB وNA، 25 جدایه مشکوك به پوسیدگی نرم انتخاب و پس از انجام آزمونهاي کلیدي چون soft rot، اکسیداز، OF، آرژنین دي هیدرولیزه، لوان، فوق حساسیت روي توتون، حدود 20 جدایه متعلق به گونه هاي جنس Pectobacterium و دو جدایه متعلق به Dicheya chrysanthemi تشخیص داده شدند که با آزمونهاي تکمیلی فیزیولوژي و بیوشیمیایی تایید شدند.
آزمونهاي مولکولی شامل آزمون rep PCR براي تشخیص تنوع بین جدایه ها با دو آغازگر BOX وERIC و آنالیز اختصاصی با آغازگرهاي EXPCCR/EXPCCF براي شناسایی اختصاصی carotovorum subsp. carotovorum P.، ADE1/ADE2 براي شناسایی D. chrysanthemi و ECA1f/ECA2r براي شناسایی atrosepticum P. انجام شد. هفت جدایه متعلق به P. carotovorum و دو جدایه متعلق به D. chrysanthemi و یک جدایه متعلق به P. atrosepticum تشخیص داده شد.
مقدمه
پوسیدگی نرم از بیماریهاي مهم گلهاي زینتی در گلخانه ها است که به دلیل شرایط مساعد رشد پاتوژن - رطوبت و دما - روي قسمتهاي مختلف گیاهان - غده، بذر، ساقه، ریشه - مشاهده می شود. این بیماري ها توسط عوامل مختلف قارچی و باکتریایی ناشی می شود. باکتریهاي عامل پوسیدگی نرم از جنس هاي Xanthomonas, Pseudomonas, Flavobacterium, Clostrodium, Bacillus, Pectobacterium, Dickeya می باشند. علائم بیماري ابتدا در جوانه ها و شاخه ها و برگها به صورت رشد ضعیف و زرد شدن روي می دهد. در شرایط گرم و مرطوب این علائم به سرعت گسترش می یابند و به زخمهاي پوسیده تبدیل می شوند. زخمها اغلب از ریشه ها و یا قسمت طوقه آغاز شده و کم کم به نواحی بالا تر گیاه می رسند - . - Wright, 1998; Snijder &Van Tuyl, 2002
پوسیدگی توسط آنزیمهاي لیز کننده پروتئازها، پلی گالاکترونازها و پکتات لیازهاي مترشحه از باکتریها صورت می گیرد - . - Lianghua et al., 2009 این آنزیمها شدت بیماریزایی را روي دیواره سلولی و غشاي میانی سلول گیاهی افزایش داده و موجب نفوذ و کلنیزه کردن بافت گیاهی می شوند . - Barras et al., 1994 ; Prombelon & Salmond, 1995 - اولین بار در جهان عامل Pectobacterium carotovorum توسط Jones در سال 1901 از هویج جداسازي شد و آن را Bacillus carotovorus نامید - . - Graham,1964 برآورد اقتصادي پوسیدگی نرم در جهان مشکل است اما خسارت سالانه آن در حدود 5-100 میلیون دلار تخمین زده شده می شود .
- Perombelon & Kelman,1980 - از لحاظ اقتصادي سه گونه P. D. chrysanthemi, carotovorum و P. atrosepticum بیشترین خسارت را در بین عوامل پوسیدگی نرم باکتریایی به محصولات کشاورزي وارد می آورند - . - Perombelon, 2002 در مطالعات فیلوژنی خانواده Enterobacteriaceae مبتنی بر مقایسه توالی هاي ژن 16sr RNA وآنالیز اسیدهاي چرب که توسط Hauben و همکاران در سال 1998 انجام شد گونه هاي جنس Erwinia در سه گروه مجزا از Pantoea قرار داده شدند. گونه ها و زیر گونه هاي پکتولیتیک را در جنس Pectobacterium و بقیه را در جنس Erwinia، Brenneria طبقه بندي کردند. Garden و هکاران در سال 2003 با بررسی هاي سرولوژیکی، همولوژي DNA و مقایسه توالی هاي16s rRNA پیشنهاد کردند که زیر گونه هاي P. c . b و P. c. w و P. c . a به سطح گونه ارتقا یابند. با این وجود هر دو طبقه بندي در منابع علمی مورد استفاده قرار می گیرد . - Costa et al., 2006 -
مواد و روشها:
-1 جمع آوري نمونه ها از اواخر آبان ماه سال1387 لغایت اواخر آبان ماه سال 1389 از گلخانه هاي بزرگ و نیز از فضاي سبز کشت و پرورش گلها و گیاهان زینتی در غرب مازندران - شهرهاي رامسر، تنکابن، نشتارود، عباس آباد، سلمانشهر، کلارآباد، چالوس و نوشهر - بازدید به عمل آمد و از گیاهان زینتی چون اگلونما، سینگونیوم، پتوس، دراسنا، سیکاس، بگونیا و غیره با علائم مشکوك به پوسیدگی نرم نمونه برداري شد. نمونه هاي آلوده برگ، ساقه، ریشه، غده، پس از شستشوي اولیه با آب، به وسیله الکل %70 به مدت 1 دقیقه ضدعفونی سطحی شد و سپس با آب مقطر سترون شستشو شدند.
قطعاتی از مرز بافتهاي سالم و آلوده با تیغ سترون برش داده شد و به صورت جداگانه به ظروف پتري حاوي یک میلی لیتر آب مقطر سترون منتقل شد. پس از ده دقیقه از سوسپانسیون بدست آمده یک لوپ روي محیط کشت آگار مغذي - Nutrient Agar - NA به صورت مخطط کشت گردید. پتري هاي کشت شده در دماي 25oC به مدت 48-72 ساعت نگهداري شد و سپس تک کلنی هایی که از لحاظ مرفولوژي متفاوت بودند انتخاب و روي محیط کشت آگار مغذي خالص سازي شدند.
-2 آزمون اثبات بیماري زایی اثبات بیماریزاي کلیه استرین هاي عامل پوسیدگی به روش تلقیح روي برشهاي غده سیب زمینی انجام شد. جهت مشاهده تولید یا عدم تولید پوسیدگی، پتري ها به مدت 48 ساعت در دماي 25oC نگهداري شدند - Perombelon & Van Der . - Wolf, 2002 یک جدایه به عنوان جدایه نماینده انتخاب و روي گیاه میزبان آن که سینگونیوم بود تست بیماري زایی انجام شد. آزمون لهیدگی روي دیسکهاي ساقه گیاه میزبان سینگونیوم نیز با روش مشابه دیسکهاي سیب زمینی صورت گرفت. براي ارزیابی قدرت تولید پوسیدگی توسط باکتري هاي پاتوژن بدست آمده از نمونه هاي گیاهی - سینگونیوم - ، سوسپانسیون باکتریها در غلظت 108cfu / ml توسط سرنگ به محل طوقه گیاه میزبان تزریق شد و توسط پارافیلم کاملا پوشانیده شد - . - Dickey, 1981;
بررسی خصوصیات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی جدایه هاي پاتوژن:
آزمونهاي کلیدي که براي تشخیص پکتوباکتریوم ها انجام شد شامل موارد زیر بود: مشاهده مورفولوژي کلنی روي محیط کشت هاي KB،NA و لوان، اکسیداز - - Kovacs, 1956، رشد بی هوازي و هوازي، لهاندن برشهاي سیب زمینی، کاتالاز، هیدرولیز ژلاتین - Lelliott & Stead, 1987; Dickey & Kelman, 1988 - ، تولید پکتیناز و فسفاتاز - Lelliott & - Stead, 1987، آزمون گرم - Schaad, 1988 - ، تست حساسیت به اریترومایسین و تولید ایندول - Dickey & - Kelman, 1988، تولید اسید از مالونات و تولید مواد احیا کننده از سوکروز و آزمون متیل رد - - Dye, 1969، احیا نیترات، اوره از، تحمل نمک طعام، آرژنین دي هیدرولاز و هیدرولیز کازئین - . - Schaad,1988 هیدرولیز توئین 80، هیدرولیز نشاسته، تولید سولفید هیدروژن - تولید H2S از سیستئین - - Schaad,2001 - و استفاده از منابع کربوهیدرات، اسید آمینه با استفاده از محیط کشت آیرس . - Schaad, 2001 - با نتایج حاصل، دو عامل پوسیدگی نرم.Pectobacterium spp و Dickeya شناسایی شد.
آنالیز : - Polymerase Chain Reaction - PCR
براي تعیین شباهتها و تنوع بین جدایه ها از روش rep-PCR استفاده شد. در این روش، توالی هاي تکراري با دو آغازگرBOX و ERIC طبق پروتکل Radermaker and De Bruijn, 1997 تکثیر شد. به منظور شناسایی زیر گونه P. carotovorum subsp. carotovorum از جفت آغازگر اختصاصی EXPCCR/EXPCCF و به منظور شناسایی گونه هاي Dickeya chrysanthemi از آغازگر هاي اختصاصی ADE1 وADE2 و برا ي شناسایی P. atrosepticum از آغازگر ECA1f/ECA2r استفاده شد.
نتایج:
پس از نمونه برداري از قسمتهاي مختلف گیاه مانند ریشه، ساقه، برگ و غده با علائم پوسیدگی نرم باکتریایی و کشت روي محیط کشت آگار مغذي، یک نوع باکتري گرم منفی داراي کلنی هاي بی رنگ، مدور با حاشیه صاف و منظم که ویژگی هاي گروه پکتوباکتریوم ها را داشت، جداسازي شد. تمامی جدایه هاي حاصل از گیاهان میزبان، روي محیط کشت NA از لحاظ اندازه، حاشیه کلنی و حالت لعابی با هم متفاوت ولی تماما از لحاظ رنگ کلنی مشابه بودند.
تمامی جدایه ها گرم منفی، کاتالاز مثبت، اکسیداز منفی، بی هوازي اختیاري و روي محیط کشت KB فاقد رنگریزه فلورسنت بودند. در آزمون لهیدگی سیب زمینی تمام جدایه داراي این قابلیت بودند. بیش از 95% جدایه ها در محیط NaCl 5% رشد داشتند. تمامی جدایه ها توانایی تولید گاز H2S از سیستئین را داشتند. استرین هاي باکتریایی در آزمون قندهاي ترهالوز، دي تارترات، آرابیتول، 2-Keto-D-Gloconate، مالونات، رفتارهاي متفاوتی را نشان دادند اما بیش از 95% جدایه ها قابلیت رشد روي محیط قندي و تولید اسید را داشتند.
