بخشی از مقاله
چکیده
شناسایی بقایاي بیولوژیک بز وحشی و تشخیص آنها از بز اهلی می تواند کمک شایان توجهی در جهت مدیریت حفاظت محیط زیست باشد. یکی از آسیب هاي وارده به این بخش از ذحایر ژنتیکی و طبیعی شکار غیر مجاز و معدوم ساختن آثار ظاهري مشخصه این حیوانات است. بنابراین ایجاد روشی ساده براي شناسایی بقایاي حیوانات وحشی واهلی از یکدیگر ضروري بنظر می رسد.
در پژوهش حاضر به منظور شناسایی کل و بز وحشی واهلی اقدام به جمع آوري نمونه از بقاي بیولوژیک حیوانات مذکور از زیستگاه هاي دام هاي وحشی شد. جهت شناسایی کل وبز وحشی واهلی از دیگر گونههاي پستاندار آن زیستگاهها پرایمرهاي اختصاصی براي ناحیه اي حفاظت شده سیتوکروم b طراحی شد و با استفاده از واکنش هاي PCR قطعه اي به طول 180 bp تکثیر گردید. اختصاصی بودن پرایمرها با DNA حیوانات دیگر مورد آزمون قرار گرفت و هیچ قطعه اي تکثیر نگردید.
براي تشخیص بز وحشی از اهلی قطعه اي به طول 730 bp تکثیر و با استفاده ازآنزیم Bamh I مورد هضم آنزیمی قرار گرفت. امکان شناسایی حیوانات اهلی ووحشی با ایجاد دو قطعه به طولهاي 230 و 500 bp در بز وحشی و عدم برش در بزهاي اهلی، از یکدیگر مهیا شد. نتایج پژوهش حاضر می تواند جهت حفظ گونه بز وحشی در محیط زیست براي حفظ تنوع زیستی در اکوسیستم ومبارزه با شکارچیان متخلف مورد استفاده قرار گیرد.
مقدمه
بر مبناي شواهد تاریخی اهلی شدن کل وبزبراي اولین بار در حدود 11000 سال قبل در غرب رشته کوههاي زاگرس اتفاق افتاده است . - Brufoord et al,2003 - با توجه به اقلیم خشک ایران و مناسب بودن این حیوان براي راهپیماییهاي دشوار، استفاده از این حیوان به عنوان دام غالب در مناطق خشک وکوه پایه اي مورد استقبال دامداران واقع شده است. حفظ و نگهداري این گونه نیازمند ایجاد روشی علمی وساده در برخورد با شکارچیان غیر مجاز میباشد. در حال حاضر مقایسه و تجزیه و تحلیل DNA میتوکندري - mtDNA - روشی مناسب براي شناسائی گونه ها است.
این موضوع ناشی از عدم نوترکیبی درmtDNA، توارث مادري، درجه بالایی از تغییرات بین گونه اي و نیز وجود تعداد زیادي از کپی هاي آن در سلول در مقایسه با DNA موجود درهسته است، که آنرا براي تجزیه و تحلیل بقایاي بیولوژیک بجاي مانده و نمونه هاي تجزیه شده به ابزاري مناسب تبدیل کرده است. در سالهاي اخیر محققین از ژنهاي مختلفی براي شناسایی گونه ها استفاده کرده اند.
اما ژنهاي سیتوکروم b و سیتوکروم اکسیداز - COI - I بیشتر از سایرین براي شناسایی گونه مورد استفاده قرار گرفته است - . - Lee et al., 2008; Riviere-Dobigny et al., 2009; Linares et al., 2009 تحقیق حاضر با توجه به اهمیت پرورش بز در ایران، حفظ و نگهداري از گونه هاي وحشی وکمک به مدیریت حفاظت از این ذخایر طبیعی انجام شد.
مواد وروش ها
نمونه دام هاي اهلی به صورت خون گیري از دام هاي موجود در گله هاي داشتی مناطقی که نمونه هاي دام وحشی تهیه شده بود انجام شد که به صورت خون گیري ازورید وداج حیوانات مذکور بود. همچنین نمونههاي مربوط به دام هاي وحشی شامل نمونه بافت عضله از طریق بانک ژن سازمان حفاظت محیط زیست کشور تهیه شد.که بعداز جمع اوري در-20 °Cقرار داده شد.
با توجه به قرابت نزدیک گوسفند وبز اطلاعات اولیه در مورد توالیهاي سیتوکروم b گوسفند و بز از طریق سایت NCBI دریافت شد و توسط نرمافزار CLC DNA Work bench مطابقت داده شد. براي کاهش هزینه در طراحی پرایمر براي شناسایی گونه از یک پرایمرforward که براي سایر گونه ها مانند گوسفند وگاو نیز قابل به کار گیري بود ویک پرایمر reverse اختصاصی بز استفاده شد - جدول - 1 براي عملکرد بهتر واختصاصی پرایمر فوق را با DNA حاصل از گونه هاي مشابه وهم خانواده از قبیل گاو وگوسفند مورد ازمون قرار گرفت.
در طراحی پرایمر سیتوکرومb براي شناسایی حیوان وحشی واهلی براي سهولت بیشتر کار با استفاده از پرایمرforward اقدام به تکثیر قطعه مورد نظر با اندازه 730 bp شد - جدول. - 1 براي شناسایی حیوان اهلی ووحشی از تکنیک RFLP استفاده شد براي این منظور توالی هاي سیتوکروم bکل وبز وحشی و اهلی را با استفاده از نرم افزارCLC DNA Work bench 5 مطابقت داده شده وسپس براي یافتن جایگاه برش از برنامه Web Cutter استفاده شد. براي تشخیص بز اهلی ووحشی از همدیگر از انزیم Bamh I استفاده شد که این آنزیم موجب می شود در دامهاي وحشی باند 730 bp تکثیر یافته با PCR در طی هضم انزیمی تبدیل به دو باند500 bp و230 bp تبدیل شود.
DNA نمونه هاي گرداوري شده بااستفاده از کیت High Pure PCR Template Preparation Kit شرکت - Roche - استخراخ شد. براي تکثیر نواحی هدف توالی mtDNA، در واکنش زنجیرهاي پلیمراز ابتدواس رشته سازي به مدت 5دقیقه در دماي 95 °C انجام شد وسپس 30 چرخه حرارتی زیر به کار گرفته شدواس: رشتسازي 95 °C به مدت 60 ثانیه، اتصال آغازگرها 62/5 °C به مدت 60 ثانیه و بسط زنجیره به مدت 60 ثانیه در 72 °C انجام شد.
در انتها نیزجهت بسط محصولات نهایی بدست آمده به مدت 5دقیقه در دماي 72°C تیوپ هاي PCR در ترموساکلر قرار داده شد. در هر واکنش PCR به حجم 25 µL مقدار3µL از بافر 10Xو2µLاز محلول MgCl2 با غلظت 50mM ومقدار 1µL از dNTPباغلظت 10mMوtaqpolymerase./16µL و 2µLاز DNA میتوکندریاي و 1 µL از هر پرایمرهاي Forward وRevers به حجم کلی محلول اضافه شده وبقیه ان تا 25µLبا آب مقطر دیونیزه شده تکمیل شد.
نتایج وبحث
شناساي گونه بز از سایر گونه هاي موجود در آن منطقه با تکثیر قطعه 180bp از DNA بز و عدم تکثیر آن از نمونه هاي سایر گونه ها با موفقیت انجام شد. براي شناسایی بز وحشی و اهلی از همدیگر، پس از تکثیر قطعه bp730 ، قطعه مورد نظر با استفاده از آنزیم BamhÏ مورد هضم آنزیمی قرار گرفت که در نتیجه هضم آنزیمی در گونه وحشی باند bp730 به دو باند با طول 230و500 تبدیل شد - شکل . - 1 ولی DNA گونهي اهلی با این آنزیم برش نمیخورد. یافتههاي این آزمایش بیانگر دستیابی به روشی ارزان وقابل اعتماد وساده براي شناسایی گوشت بز و شناسایی گونه اهلی از وحشی میباشد. - Dooley & Garrett, 2001; Dooley et al ., 2005 - اشاره داشتند که تکنیک RFLP یکی از ارزان ترین وقابل اعتمادترین رو شها در شناسایی گوشت گاو وبز وگوسفند وجوجه می باشد.
در طرف مقابل - - Girish et al., 2007 با تاکید بر این نکته که این تکنیک داراي مزایاي زیادي میباشد ولی اشاره داشتند در مورد نمونهاي که دچار فرایند شوند به علت عدم تکثیر توالیهاي بزرگ که اغلب در این تکنیک مورد نیاز است دچار نقص میباشد، که در صورت تکثیر قطعهي کوچک و قرار دادن جایگاه برش در قطعه مورد نظر میتوان بر این مشکل نیز فائق آمد.
نتایج بدست آمده از این تحقیق توانایی این روش را به عنوان ابزاري نیرومند در شناسایی گونه بز از دیگر گونهها وهمچنین تشخیص اهلی و یا وحشی بودن دام مذکور را نمایان می سازد. نتایج پژوهش حاضر جهت ایجاد راهکارهایی در جهت حفظ گونه در محیط زیست براي حفظ تنوع ژنتیکی در اکوسیستم ومبارزه با شکارچیان متخلف در مدیریت زیستگاههاي طبیعی ،ازاهمیت بهسزاي برخوردار است.
