بخشی از مقاله
چکیده
ویروس هپاتیت C عامل التهاب کبد است که اغلب از راه خون آلوده منتقل میشود. این ویروس عامل حدود %80 از موارد هپاتیت ایجاد شده در اثر انتقال خون میباشد. با توجه به اینکه فقط درحدود %35 از بیماران مبتلا به هپاتیت C علائم هپاتیت حاد را نشان میدهند، بنابراین اکثر بیماران بدون ظهور علائم بیماري میباشند. کیتهاي تشخیصی مختلفی بر مبناي EIA به صورت تجاري براي شناسایی آنتیباديهاي HCV در دسترس هستند ولی به دلیل توزیع جغرافیایی متفاوت ژنوتیپ هاي HCV ، این کیتها همیشه به طور کاملاً صحیح در نقاط مختلف دنیا نمیتوانند کاربردي باشند.
علاوه بر این، این کیت هاي EIA از 3 الی 6 پپتید یا آنتیژن نوترکیب از پروتئینهاي ساختاري و غیرساختاري ویروسی استفاده میکنند. نیاز به چندین پپتید یا پروتئین نوترکیب چندگانه به منظور تشخیص قابل اطمینان عفونتهاي HCV، هزینه این کیتها را بالا می برد. هزینهي بالاي کیتهاي تشخیصی HCV استفاده از آنها را در کشورهاي در حال توسعه با محدودیت روبرو میکند. ما در این پروژه با استفاده از روشهاي بیوانفورماتیک، یک پروتئین چند اپیتوپی نوترکیب را طراحی کردیم که حاوي چندین اپی توپ غالب، خطی و حفظ شدهي اختصاصی از پروتئینهاي ساختاري و غیرساختاري ویروس HCV میباشد.
مقدمه
هپاتیت یک بیماري سیستمیک است که عمدتاً کبد را گرفتار میکند. یکی از مهمترین عوامل ایجاد هپاتیت حاد و مزمن در کشورهاي توسعه یافته، هپاتیت C میباشد. طبق آمار سازمان بهداشت جهانی - WHO - بیش از 170 میلیون نفر در دنیا مبتلا به هپاتیت C هستند که سالانه 3-4 میلیون نفر به آنها افزوده میشوند 1 - و . - 2 ویروس هپاتیت C در جنس هپاسی ویروسها و خانواده فلاويویریده ردهبندي شده است.
این ویروس داراي پوشش لیپیدي است و ژنوم آن یک مولکول RNAي تک رشتهاي مثبت به طول تقریبی 9/5 kb میباشد. ژنوم ویروس شامل تنها یک ORF کدکننده پلی پروتئینی با -3033 3010 ریشهي آمینو اسیدي است. پلیپروتئین HCV پس از ترجمه مورد پردازش قرار میگیرد و چندین پلیپپتید ساختاري1 و غیرساختاري1 را میسازد که پروتئینهاي ساختاري شامل یک پروتئین core و دو پروتئین پوششی بوده و پروتئینهاي غیرساختاري داراي فعالیتهاي آنزیمی مختلفی میباشند. مشابه سایر ویروسهاي RNAیی، ژنوم HCV ناهمگونی ژنومی قابل توجهی را نشان میدهد.
شش گروه ژنتیکی مشخص از ایزولههاي HCV که در واقع شش ژنوتیپ مختلف را میسازند و تعداد زیادي از سابتایپهاي2 خویشاوند بسیار نزدیک که در اثر تجمع جهشهاي مختلف در ژنوم RNAیی HCV حاصل میشود، در سطح جهان شناسایی شدهاند. ژنوتیپها به صورت 1 تا 6 و سابتایپها تحت عنوان a, b, c, … نامگذاري میشوند. از آنجاییکه فقط درحدود %35 از بیماران مبتلا به هپاتیت C علائم هپاتیت حاد را نشان می دهند، بنابراین اکثر بیماران بدون ظهور علائم بیماري میباشند.
اگر سیستم ایمنی فرد آلوده شده در مدت 6 ماه قادر به پاکسازي کامل ویروس از خون نباشد، هپاتیت C مزمن بوجود میآید. کیتهاي تشخیصی مختلفی بر مبناي 3EIA به صورت تجاري براي شناسایی آنتیباديهاي علیه HCV موجود در پلاسما در دسترس هستند ولی به دلیل توزیع جغرافیایی متفاوت همه ژنوتیپهاي HCV در جهان، این کیتها همیشه به طور کاملاً صحیح در نقاط مختلف دنیا نمیتوانند کاربردي باشند.
علاوه بر این، این کیتهاي تشخیصی از سه الی شش آنتیژن نوترکیب از پروتئینهاي ساختاري و غیرساختاري ویروسی استفاده میکنند. نیاز به چندین پپتید یا پروتئین نوترکیب چندگانه به منظور تشخیص قابل اطمینان عفونتهاي HCV، هزینه این کیتها را بالا میبرد. همین بالا بودن هزینه کیتهاي آنتی HCV یک عامل محدود کننده براي استفاده از این کیتهاي گران در کشورهاي در حال توسعه است.
هدف این پروژه طراحی یک پروتئین چند اپیتوپی نوترکیب واحد میباشد بهطوریکه حاوي چندین اپیتوپ غالب4، خطی و حفظ شده اختصاصی از پروتئینهاي ساختاري و غیرساختاري ویروس HCV باشد. ژنهاي کدکنندهي این اپیتوپها به صورت پشت سر هم5 در یک ORF واحد، با لینکرهاي مناسب طراحی شدند. در نهایت پس از طراحی ژن حاوي اپیتوپهاي هدف، توالی برچسب6 پلی هیستیدینی - poly-His tag - جهت تسهیل تخلیص پروتئین نوترکیب اضافه گردید. انتظار میرود پروتئین بدست آمده به عنوان capture antigen در ساخت کیتهاي تشخیصی HCV مبتنی بر روش EIA مورد استفاده قرار گیرد و به این ترتیب نیاز به چند پروتئین آنتیژنیک بوسیلهي یک فیوژن پروتئین7 چند اپیتوپی مرتفع گردد.
روشها
نرم افزار EditSeq، نرمافزار MegAlign - به روش - Clustal W، نرمافزارهاي آنلاین پیشبینی کننده ساختار پروتئین - قابل دسترس در سایت - ExPasy، نرمافزار PyMOL، نرمافزارهاي آنلاین Optimizer و .NEB cutter
نتایج و بحث
براي طراحی یک پروتئین نوترکیب چند اپیتوپی که بتواند کاربرد تشخیصی داشته باشد، اپیتوپهاي خطی ایمونودامینانت و حفظ شده که تواناییشان در القاء آنتیباديهایی بر علیه HCV در مطالعات پیشین به اثبات رسیده است لازم است 4 - و . - 5 براي این منظور توالی نوکلئوتیدي کد کننده پلیپروتئین هر کدام از سابتایپها از پایگاه اطلاعاتی NCBI استخراج شده و با نرم افزار EditSeq، ORF آنها به توالی پروتئین ترجمه گردید - اطلاعات نشان داده نشده - . به این ترتیب توالی پروتئینی اپیتوپهاي مورد نظر بدست آمد و با توالی پروتئینی موجود در مقالات مقایسه گردید.
این اپیتوپها شامل یک اپیتوپ از هرکدام از پروتئینهاي NS4II ,NS4I ,NS3 ,core و NS5 میباشد. توالی هدف براي هر کدام از این اپیتوپها بایستی توالی مورد توافق1 در میان شش ژنوتیپ ویروس HCV باشد. براي این منظور توالی مربوط به اپیتوپ مورد نظر از هر 6 ژنوتیپ را با استفاده از نرمافزار MegAlign - به روش - Clustal W همردیف کردیم. توالی مورد توافق به دست آمده را به ترتیب ذکر شده پشت سر هم و با واسطهي توالی لینکر انعطافپذیر [GSGSG] طراحی نمودیم. سپس توالی برچسب پلی هیستیدینی به انتهاي کربوکسی این فیوژن پروتئین چند اپیتوپی2 اضافه گردید - شکل . - 1
براي اطمینان از صحت توالی پروتئین نوترکیب طراحی شده و اینکه این پروتئین منجر به شناسایی ارگانیسمهاي غیرهدف نمیگردد - اجتناب از پاسخهاي مثبت کاذب - ، توالیهاي مشابه این پروتئین با جستجوي BLAST بررسی گردید - اطلاعات نشان داده نشده - . در مرحله بعد با استفاده از نرمافزارهاي آنلاین پیشبینی کننده ساختار پروتئین - قابل دسترس در سایت - ExPasy و مشاهده فایل PDB با استفاده از نرمافزار PyMOL از صحت نتیجه اطمینان حاصل گردید - شکل . - 2 نمایش سه بعدي پروتئین طراحی شده با استفاده از نرم افزار فوق در دسترس بودن هر 5 اپیتوپ را به لحاظ فضایی تأیید کرد.
