بخشی از مقاله
خلاصه
موضوع : هموفیلی A یک اختلال شایع انعقاد خون ناشی از کمبود فاکتور 8 با وراثت وابسته به جنس مغلوب می باشد که فراوانی آن حدود 1 در 5000 تا 10000 نوزاد پسر در سراسر جهان گزارش شده است. هموفیلی A توسط طیف گسترده ای از نقص های مولکولی در ژن فاکتور 8 ایجاد می شود. شایع ترین جهش، وارونگی اینترون 22 است که این وارونگی می تواند توسط روش ساترن بلات ، LD-PCR و IS-PCR شناسایی شود.
اهداف: این مطالعه با هدف تعیین وارونگی اینترون 22 نوع 1 و نوع 2 در بیماران هموفیلی A و هم چنین شناسایی ناقلین جهش مورد نظر با استفاده از روش IS-PCR در جمعیت استان قم صورت گرفت.
روش تحقیق: در این مطالعه توصیفی 30 بیمار مبتلا به هموفیلی A مراجعه کننده به درمانگاه طباطبایی استان قم و همچنین تعدادی از بستگان مؤنث بیماران مورد نظر مورد بررسی قرار گرفتند . استخراج DNA ژنومی از لکوسیت های خون محیطی به روش Salting out صورت گرفت .در روش IS-PCR ، DNA های استخراج شده پس از حلقوی شدن - هضم شدن توسط آنزیم محدود کننده ی BclI و سپس اتصال انتهای قطعات حاصل توسط آنزیم لیگاز - ، به عنوان الگو برای تکثیر PCR مورد استفاده قرار گرفتند و سپس محصول PCR با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز % 1/5 مورد بررسی قرار گرفت.
دستاوردهای مقاله: طبق نتایج بدست آمده ،% 35 از بیماران هموفیلی A شدید وارونگی اینترون 22 را داشتند . - 2/7 - 28% از بیماران دارای وارونگی نوع 1 و - 5/7 - 72% از بیماران دارای وارونگی نوع 2 بودند. هم چنین از 9 نفر که برای وضعیت ناقل بودن مورد آنالیز قرار گرفتند ،2 مورد فاقد آلل جهش یافته ، 5 نفر ناقل وارونگی اینترون 22 نوع 2 و 2 نفر ناقل وارونگی اینترون 22 نوع 1 بودند. نتایج این مطالعه نشان داد تکنیک IS-PCR روشی دقیق ، سریع و قابل اعتماد جهت شناسایی جهش وارونگی اینترون 22 نوع 1 و نوع2 در بیماران هموفیلی A و همچنین ناقلین می باشد.
.1 مقدمه
هموفیلی A شایع ترین اختلال خونریزی دهنده وابسته به کروموزوم X مغلوب ناشی از کاهش فعالیت فاکتور VIII به دلیل جهش های ناهمگون در ژن کد کننده ی فاکتور VIII می باشد .{1} شیوع این بیماری، حدودا 1:5000 تا 1:10000 نوزاد زنده ی پسر در سراسر جهان می باشد.{2} بیماری هموفیلی A بسته به سطح فعالیت انعقادی فاکتور VIII به انواع هموفیلی A شدید - فعالیت انعقادی فاکتور 8 کمتر از% - 1 ، متوسط - فعالیت انعقادی فاکتور 8 ، - 1-5%و خفیف - فعالیت انعقادی فاکتور 8 بیشتر از% - 5 طبقه بندی می شود که فراوانی آن ها به ترتیب 50 %، 10%و 40% بیماران هموفیل A می باشد.
در هموفیلی A شدید و متوسط ، بیماری با اپیزودهای خونریزی درون مفاصل - همارتروزها - ،بافت های نرم و عضلات ، به دنبال ضربات خفیف یا حتی به صورت خود به خودی ایجاد می شود و در هموفیلی خفیف ، خونریزی عمدتا بر اثر ضربه - تروما - یا جراحی ایجاد می شود و بصورت خود به خودی نیست.
ژن فاکتور VIII بر روی بازوی بلند کروموزوم - Xq28 - X قرار دارد. بیش از 186 کیلوباز از DNA ژنومی را پوشانده و متشکل از 25 اینترون و 26 اگزون است که یک پروتئین بالغ 2332 اسید آمینه ای را رمز می کند..{5-7} از زمان انتشار توالی ژن فاکتور VIII در سال 1984 تعداد زیادی از جهش ها شامل بازآرایی های ژنی ، جانشینی های تک بازی ، حذف ها و اضافه شدگی ها که باعث هموفیلی A می شدند شناسایی شده است . شایع ترین آنها وارونگی اینترون 22 و اینترون 1 ژن فاکتور VIII می باشد که به ترتیب در 40-50% و 5-7% بیماران با هموفیلی A شدید رخ می دهد.
اینترون 22 حدودا 32 کیلوباز طول دارد که شامل یک منطقه ی غنی از GC و دو ژن F8A و F8B می باشد. یک توالی 9/6 کیلوبازی - Int22h-1 - در منطقه ی غنی از GC اینترون 22 وجود دارد که در موقعیت های تقریبا 300 کیلوبازی - پروگزیمال ، - Int22h-2 و 400 کیلو بازی - دیستال ، - Int22h-3 در انتهای تلومریک ژن فاکتور 8 دارای نسخه های مشابهی است.
وارونگی اینترون 22 ناشی از نوترکیبی همولوگ بین نسخه ی داخل ژنی - - Int22h-1 و یکی از دو همولوگ خارج ژنی Int22h-2 - یا - Int22h-3 می باشد.در اثر وارونگی، اگزون های 1- 22 معکوس شده و در جهت مخالف با اگزون های 23-26 قرار می گیرد که این موجب گسست و قطع ژن فاکتور 8 می شود . بسته به اینکه کدام همولوگ خارج ژنی در وارونگی شرکت کند، دو نوع وارونگی نوع 1 - که اینترون 22h-3 در ایجاد نوترکیبی دخالت دارد - و نوع 2 - که اینترون 22 h -2 در ایجاد نوترکیبی دخالت دارد - به وجود می آیند
شکل -1 وارونگی اینترون 22 دیستال - نوع - 1 و پروگزیمال - نوع - 2 ژن فاکتور .{10} VIII
به طور کلی دو روش مختلف برای ارزیابی ژنتیکی جهش های عامل هموفیلی A وجود دارد : آنالیز پیوستگی - تشخیص غیر مستقیم - و شناسایی جهش ها در ژن فاکتور - VIII تشخیص مستقیم - . آنالیز پیوستگی می تواند تا % 99 برای بیمارانی با سابقه خانوادگی هموفیلی قابل اعتماد باشد - هموفیلی ارثی - . نیاز اصلی برای آنالیز پیوستگی ، هتروزیگوسیتی نشانگرهای پلی مورفیک در مادر فرد شاخص است.
این امر مستلزم یک استراتژی برای آنالیز پی در پی پلی مورفیسم های مختلف ژن فاکتور VIII وابسته به میزان هتروزیگوسیتی در جمعیت می باشد . تشخیص مستقیم جهش های عامل بیماری به طور فزاینده ای در تشخیص ژنتیکی هموفیلی استفاده می شود. این روش دقتی حدودا 100% دارد و در % 95 از خانواده های مبتلا به هموفیلی A کار آمد است این روش در تشخیص جهش در هر دو نوع هموفیلی های ارثی و تک گیر موثر است،حتی در شرایطی که یک فرد در خانواده مبتلا باشد.
روش های ارزیابی ژنتیکی وارونگی اینترون 22 شامل ؛ آنالیز ساترن بلات توصیف شده توسط Lakich و همکارانش در سال 1993 ، روش LD-PCR ارائه شده توسط Bagnall و همکارانش در سال 2006 و تکنیک IS-PCR توصیف شده توسط Rossetti و همکارانش در سال 2008 می باشند
طبق اطلاعات ما در کل کشور بالغ بر 6000 بیمار هموفیلی A و B وجود دارند که سالانه 55 میلیارد تومان فقط صرف وارد کردن داروها و فاکتورهای انعقادی آن ها می شود. از دیگر مواردی که باید در این گروه از بیماران مد نظر داشت، هزینه های بالای درمانی و اشغال تخت های بیمارستانی به دلیل عدم داشتن برنامه های درمانی مدون در منزل است
در بیماران هموفیلی A، تشخیص نوع موتاسیون به روشی قابل اعتماد در پی بردن به احتمال تولید مهار کننده علیه فاکتورهای درمانی دریافتی، انتخاب موارد درمانی مناسب و جلوگیری از تولد نوزادان مبتلا به بیماری در ناقلین هموفیلی مفید خواهد بود. در ایران در این زمینه مطالعات بسیار کمی صورت گرفته است و تا کنون هیچگونه بررسی ژنتیکی در ارتباط با بیماران هموفیل استان قم صورت نگرفته است و همچنین ضرورت انجام مشاوره با توجه به اینکه اکثریت افراد مبتلا در سنین ازدواج می باشند ایجاب میکند که مطالعاتی در این زمینه صورت بگیرد.
همانطور که گفته شد با توجه به اینکه حدودا نیمی از موارد هموفیلی A شدید به علت وارونگی اینترون 22 ژن فاکتور VIII رخ می دهد معمولا در بررسی مولکولی این بیماری ابتدا این وارونگی باید مورد بررسی قرار بگیرد. این مطالعه با هدف شناسایی جهش وارونگی اینترون 22 نوع 1 و نوع 2 ژن فاکتور 8 انعقادی در بیماران هموفیلی A شدید و همچنین ناقلین این جهش با استفاده از روش IS-PCR در جمعیت استان قم انجام گرفت.
.2 مواد و روش کار
این مطالعه ی توصیفی که با تایید کمیته اخلاق در پژوهش دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم پزشکی تهران انجام شد پس از هماهنگی لازم با کانون هموفیل استان قم به صورت تصادفی روی 30 بیمار مبتلا به هموفیلی A مراجعه کننده به بیمارستان حضرت معصومه - س - که در درمانگاه طباطبایی استان قم پرونده داشتند انجام گرفت.
از تمامی افراد برای شرکت در این مطالعه و استفاده از نمونه ی خون آن ها ، رضایت نامه آگاهانه اخذ گردید . همچنین پرسشنامه ی ویژه ای ، به منظور بررسی وضعیت بیماران که متشکل از شاخص های دموگرافیک و سؤالاتی در ارتباط با تست های انعقادی بیماران بود ، برای هر یک از افراد مورد مطالعه تکمیل شد . معیار ورود افراد به این مطالعه ابتلا اثبات شده به هموفیلی A بود.
