بخشی از مقاله
چکیده
ویروس مرتبط با کوتولگی زرد تلخه بیان - Sophora yellow stunt- associated virus, SYSaV - ، یکی از اعضای جنس Nanovirus و خانواده Nanoviridae می باشد. در این پژوهش آلودگی گیاهان خانواده حبوبات شامل نخود ایرانی و عدس به SYSaV که از مزارع حبوبات استان اصفهان جمع آوری شده بودند در آزمون PCR مورد بررسی قرار گرفت. برای این منظور، ابتدا آلودگی نمونه هایی که دارای علائم زردی، کوتولگی، ریزبرگی و زردی بین رگبرگها بودند با آغازگرهای عمومی نانوویروس ها مورد بررسی قرار گرفت.
سپس از میان نمونه های آلوده به SYSaV، قطعه ژنومی DNA-N این ویروس مربوط به یک جدایه عدس و یک جدایه نخود بعد از همسانه سازی در پلاسمید pTG، تعیین ترادف شدند. مقایسه ترادف نوکلئوتیدی قطعات ژنومی ویروس فوق با ترادف های مشابه موجود در بانک جهانی ژن نشان داد که قطعه ژنومی DNA-N نمونه عدس به میزان 93/8 درصد و نمونه نخود به میزان 94/5 درصد به SYSaV شباهت دارند و میزان شباهت این قطعه در دو جدایه با هم 98/9 درصد میباشد. این اولین گزارش از آلودگی حبوبات به SYSaV در ایران میباشد. براساس نتایج این بررسی، به نظر میرسد که SYSaV دارای گسترش نسبتا زیادی در مزارع حبوبات استان اصفهان و احتمالا ایران است.
-1 مقدمه
خانواده Nanoviridae شامل دو جنس Nanovirus و Babuvirus و یک گونه به نام Coconut foliar decay virus می- باشد که جایگاه تاکسونومیکی مشخصی ندارد . - 7 - اعضای جنس Nanovirus دارای دامنه میزبانی وسیعی میباشند که بیشتر از پنجاه گونه از گیاهان لگوم و چند گونه از غیر لگوم ها را آلوده میکند . - 7 - نانوویروس ها از حدود دو دهه پیش بعنوان عوامل محدود کننده کشت بقولات در دنیا معرفی شدهاند . - 3 -
تاکنون سه نانوویروس به نام های ویروس زردی بافت مردهی باقلا - Faba bean necrotic yellows virus, FBNYV - و ویروس کوتولگی بافت مردهی باقلا - Faba bean necrotic stunt - virus, FBNSV و ویروس مرتبط با کوتولگی زرد تلخه بیان - Sophora yellow stunt- associated virus, SYSaV - که دوتای اول از بقولات و ویروس سوم از علف هرز تلخه بیان از نقاط مختلف ایران گزارش شده اند 2 - ، 4 و . - 5 ویروس مرتبط با کوتولگی زرد تلخه بیان اولین بار از همین گیاه در محوطه دانشگاه شهید باهنر کرمان از ایران توسط حیدرنژاد و همکاران در سال 1396 گزارش شد . - 2 -
ژنوم نانوویروس ها از هشت قطعه دیاِناِی تک رشته حلقوی که اندازه هر یک 1kb است تشکیل شده است . - 7 - هر کدام از دیاِن های ژنومی نانوویروس ها پروتئین هایی را رمز میکند که تاکنون عملکرد پنج عدد از آن ها شناخته شده است. قطعه DNA-S پروتئین پوششی را رمز میکند . - 7 - پروتئین مرتبط با تکثیر Rep نام دارد که در نانوویروس ها M-Rep نامیده می-شود و توسط قطعه DNA-R رمز میشود . - 7 -
قطعه DNA-C پروتئین فعال کننده سیکل سلولی را رمز میکند که تحت عنوان پروتئین Clink نیز نامیده می شود. پروتئین Clink در غیر فعال کردن پروتئین گیاهی رتینوبلاستوما نقش دارد . - 1 - قطعه DNA-M پروتئین حرکتی را رمز میکند. پنجمین پروتئین، یعنی پروتئین شاتل هسته ای توسط قطعه DNA-N رمز میگردد . - 9 - سه قطعه دیگر به نام های DNA-U1، DNA-U2 و DNA-U3 عملکرد ناشناختهای دارند . - 7 - در این تحقیق آلودگی بقولات به SYSaV و سپس مشخصات قطعه ژنومی DNA-N دو جدایه از این ویروس از منطقه حنا واقع در استان اصفهان مورد بررسی قرار گرفته است.
-2 مواد و روشها
در فاصله ی سال های 1395-1396 از مزارع حبوبات واقع در استان اصفهان - سمیرم، فریدونشهر، لنجان، فریدن و چادگان - ، بازدید به عمل آمد و از حبوبات مختلف با علائم زردی، کوتولگی، ریزبرگی و زردی بین رگبرگ ها نمونه برداری صورت گرفت. مشخصات مربوط به هر نمونه از جمله کد نمونه، نام نمونه، علائم، محل و تاریخ جمع آوری، یادداشت شده و همه ی نمونه ها در شرایط سرد - روی یخ - به آزمایشگاه منتقل شدند. استخراج دیاِن از بافت گیاه به روش - 10 - CTAB صورت گرفت.
پس از استخراج دیاِن از بافتهای گیاهی مشکوک، آلودگی نمونه ها با استفاده از آزمون PCR به همراه آغازگرهای عمومی نانوویروس ها - جدول - 1 که قادر به تکثیر یک قطعه 1000 جفت بازی میباشند، مورد بررسی قرار گرفت. سپس از میان نمونه های آلوده، یک قطعه ژنومی SYSaV مربوط به دو جدایه عدس و نخود مربوط به منطقه حنا با استفاده از آزمون PCR و آغازگرهای عمومی تکثیر و سپس محصولات PCR بعد از همسانه سازی در پلاسمید pTG قرار داده شد. در ادامه استخراج پلاسمید نوترکیب توسط کیت High Pure Plasmid Isolation Kit - Roche, Germany - انجام شد.
در نهایت، نمونه ها برای تعیین ترادف نوکلئوتیدی به کمپانی Bioneer، کشور کره جنوبی ارسال گردید. به منظور آنالیزهای فیلوژنتیکی، ابتدا ترادف های بدست آمده ویرایش و ترادف های مربوط به پلاسمید حذف گردید. برای مقایسه ترادف ها از نرم افزار SDTv 1.2 و برای رسم درخت فیلوژنتیکی از نرم افزار MEGA7 استفاده گردید. در رسم درخت فیلوژنتیکی، برای مقایسه از ترادف نوکلئوتیدی قطعات ژنومی ویروس پرپشت شدن انتهایی موز - BBTV - بعنوان عضو خارج گروه - outgroup - استفاده شد و میزان اعتبار سنجی - bootstrap - برابر 1000 انتخاب گردید.
-3 نتایج و بحث
نتایج حاصل از آزمون PCR نشان داد از بین 107 نمونه جمع آوری شده از مناطق استان اصفهان جمعا شش نمونه شامل نخود و عدس به نانوویروس ها آلوده بودند. از بین نمونه های آلوده یک جدایه عدس و نخود انتخاب و قطعهی ژنومی DNA-N ویروس هر دو جدایه تکثیر و تعیین ترادف گردید. بر اساس نتایج بدست آمده، مقایسه ترادف نوکلئوتیدی قطعه ژنومی DNA-N فوق با ترادف های مشابه موجود در بانک جهانی ژن نشان داد که نمونه عدس به میزان 93/8 درصد و نمونه نخود به میزان 94/5 درصد به تنها جدایه SYSaV شباهت دارند و میزان شباهت این دو جدایه باهم 98/9 درصد می باشد. این اولین گزارش از آلودگی حبوبات به SYSaV در ایران و دنیا می باشد.
