بخشی از مقاله
چکیده
شناسایی قارچهای اندوفیت تاجخروس به دلیل اهمیت آن به عنوان علوفه و غذا جهت بکارگیری آنها برای بهبود رشد و کنترل بیولوژیک بیماریهای این گیاه ضروری است. ازاینرو از مزارع و باغات استانهای زنجان، تهران و البرز تعداد زیادی بوته تاجخروس جمعآوری و به آزمایشگاه منتقل شد. پس از ضدعفونی سطحی و کشت ریشهی تاجخروس در محیط کشت PDA، پرگنههای متفاوت رشد یافته پیرامون ریشه روی محیط کشت جداسازی و با بررسی های میکروسکوپی و مولکولی شناسایی شد. نتایج مشاهدات میکروسکوپی و توالی یابی ناحیه tef-1 نمونههای موردنظر نشان داد که پرگنهها به دو گونهFusarium fujikuroi و F. proliferatumتعلق دارند. این اولین گزارش از حضور این دو گونه فوزاریوم بر روی ریشه تاجخروس در ایران است.
-1مقدمه
در سالهای اخیر تولیدکنندگان و مصرفکنندگان به تولید گیاهان جدید که بتوان آنها را به عنوان جایگزین محصولات دیگر در نظر گرفت،علاقهمند شدند. اینگونه گیاهان جدید علاوهبرایجاد مواد خام در بخشهای صنعتی، بهعنوان یک منبع غذایی انسانی نیز میتوانندمورداستفاده قرارگیرند.یکی از این گیاهان تاجخروس است که از جنوب آمریکا منشا گرفته است . - 1 - گیاه تاجخروس از خانوادهیAmarantaceae، دارای 65 - 75 گونه است که40 گونه آن بومی قاره آمریکا میباشد. از این میان 17 گونه بهعنوان سبزی به مصرف میرسند و سه گونه از دانهی آن استفاده میشود و بقیه ازعلفهای هرز مهم است . - 2 -
برگ تاجخروس که در آفریقا بهعنوان سبزی مورداستفاده قرار میگیرد کمک شایانی به رژیم غذایی هم ازلحاظ ریزمغذی وهم ترکیبات فعال زیستی میکند. تاجخروس جزء سبزیهای موردعلاقهی این قاره هست در صورتیکه اکثر مردم جهان تاج-خروس را بهعنوان گیاه زینتی میشناسند. بیشتر گونههای وحشی نیز بهعنوان منبع غذایی برداشت شدهاند. همانطور که گفته شد معمولاً در آفریقا بهعنوان سبزی از تاجخروس استفاده میکنند ولی در کشورهای آمریکایی بهعنوان غلات مورداستفاده قرار میگیرد و دانهی تاجخروس در آمریکا کشت میشود و اخیراً بهطور جدیتر دانهی تاجخروس در سوپرمارکتها و کارخانههای کنیا، اتیوپی، زیمباوه، اوگاندا استفاده میشود.
ازآنجاکهتاجخروس بهعنوان یک محصول غذاییعمدتاً مقاوم در برابر حرارت، خشکسالی، بیماریها و آفات معرفی شده است و همینطور ارزش غذایی بالایی هم ازلحاظ دانه وبرگ دارد، مطالعهی بیماریها و مکانیسمهای ایجاد بیماری در این گیاه علاوه بر جذابیت فکری و توجیه علمی، یک هدف بسیار کاربردی نیز دنبال میکند و آن یافتن روشهایی برای مبارزه با بیماریهاست. کنترل بیماریها سبب افزایش کمیت و بهبود کیفیت فرآوردههای گیاهی میشود. با توحه به اهمیت و کاربرد فراوان قارچهای اندوفیت، مطالعه جمعیت اندوفیتها در میزبان و شناسایی آنها حائز اهمیت میباشد و میتواند به شناسایی منابع ژنتیکی جدیدی از مقاومت به حشرات، بیماریها و تحمل تنش محیطی کمک نماید.
-2مواد و روشها
-1نمونهبرداری، جداسازی و خالصسازی نمونهبرداری از گیاه تاجخروس از مناطق مختلف سه استان تهران، البرز و زنجان - ایجرود، ابهر، سلطانیه، طارم - در فروردین و مهرماه 1395 صورت گرفت، بدین ترتیب که از ریشههای سالم حدود صد نمونه جمعآوری شد و در پاکتهای مخصوص که این پاکتها برچسب مربوط به مشخصات گیاه تاجخروس شامل: محل جمعآوری، تاریخ جمعآوری، شخص جمعآوریکننده را به همراه دارند به آزمایشگاه منتقل شد.
بعد از انتقال نمونهها به آزمایشگاه ابتدا با آب روانشستشو داده و سپس با الکل ضدعفونی شدند. در مرحلهی بعد ریشهها به قطعات کوچک تقسیمو روی محیط کشت عصاره سیبزمینی - دکستروز- آگار - PDA - قرار دادهشدند. نمونهها به مدت سه هفته در انکوباتور در دمای 25 2نگهداری شدند و سپس پرگنه-های رشد یافته در اطراف قطعات به روش نوک ریسه خالصسازی گردید.
-2شناسایی ریخت شناسی و مولکولی
بهمنظور تحریک اسپورزایی، جدایهها به تشتکهای حاوی محیط کشت سیبزمینی-هویج-آگار - PCA - انتقال داده شد و در شرایط نور و تاریکی 12:12 در ترکیبی ازنورNUVو فلورسنت در دمای 23 تا 27 درجه سلسیوس به مدت 2-10 هفته نگهداری شدند. در این مدت جدایهها هر چند روز بررسی و بهمحض مشاهدهی اندام خاصی روی پتری، از آن اسلاید تهیه شد و ازنظر ریخت شناسیبا استفاده از کلید های شناسایی - 3 - موردبررسی قرار گرفت.
به منظور شناسایی مولکولی جدایهها، ابتدا با استفاده از محیط کشت مایع توده میسلیومی قارچ تهیه شد و سپس با روش صفایی و همکاران - 4 - دی ان آ. آنها استخراج گردید. تکثیر با استفاده از آغازگرهای tef1F - 5ʼTACAARTGYGGTGGTATYGACA 3ʼ - و - 5ʼACNGACTTGACYTCAGTRGT 3ʼ - tef1R انجام شد . - 5 - توالی- هاپس از انجام توالی یابی در بانک اطلاعات ژن NCBI بلاست گردید.
نتایج و بحث
بعد از جداسازی و خالصسازی جدایههای قارچی ابتدا شناسایی ریخت شناسی صورت گرفت. پرگنه هر دو قارچ در محیط کشت PDA به صورت سفیدرنگ و دارای رشد سریع بود. گونهی F. fujikuroi باگذر زمان سفید مایل به بنفش وF.proliferatume به سفید تبدیل و به سختی وارد فرم جنسی میشود. بعد از شناسایی ریخت شناسی برای تایید کار به شناسایی مولکولی میپردازیم. در جدایه های بررسیشده قطعه تقریبا400-500 جفت بازی مربوط به ناحیهtef-1 با استفاده از آغازگرهای tef1F و tef1R تکثیر و تعیین توالی شد.
پس از بلاست کردن توالیهای نوکلئوتیدی - - Blastn در پایگاه اطلاعاتیNCBI و تایید صحت قطعه توالییابیشده، توالیهای مورد نظر با توالیهای دریافت شده از پایگاه اطلاعاتیNCBI به کمک نرمافزار Mega 6.0 و GeneDoc همردیف شدند. بعد از شناسایی میکروسکوپی و ماکروسکوپی دو گونه فوزاریوم از تاجخروس شناسایی شد که برای اولین بار از ایران گزارششده است این گونهها عبارتاند از : F. fujikuroi, F.fproliferatum این دو قارچ به صورت اندوفیت در تاجخروس زندگی میکند وهیچ علائمی در ظاهر دیده نمیشود.
