بخشی از مقاله
چکیده
شناسایی قارچهای اندوفیت تاجخروس به دلیل اهمیت آن به عنوان علوفه و غذا جهت بکارگیری آنها برای بهبود رشد و کنترل بیولوژیک بیماریهای این گیاه ضروری است. ازاینرو از مزارع و باغات استانهای زنجان، تهران و البرز تعداد زیادی بوته تاجخروس جمعآوری و به آزمایشگاه منتقل شد. پس از ضدعفونی سطحی و کشت ریشهی تاجخروس در محیط کشت PDA، پرگنههای متفاوت رشد یافته پیرامون ریشه روی محیط کشت جداسازی و با بررسی های میکروسکوپی و مولکولی شناسایی شد. نتایج مشاهدات میکروسکوپی و توالی یابی ناحیه ITS1-5.8S-ITS2 نمونههای موردنظر نشان داد که پرگنهها به دو Chatumium gloeoporiodes و Ch.iodhpurenseتعلق دارند. این اولین گزارش از حضور این دو گونه کتومیوم بر روی ریشه تاجخروس در ایران است.
-1مقدمه
در سالهای اخیر تولیدکنندگان و مصرفکنندگان به تولید گیاهان جدید که بتوان آنها را به عنوان جایگزین محصولات دیگر در نظر گرفت علاقهمند شدند. اینگونه گیاهان جدید علاوهبرایجاد مواد خام در بخشهای صنعتی، بهعنوان یک منبع غذایی انسانی نیز میتوانندمورداستفاده قرار گیرند.یکی از این گیاهان تاجخروس است که از جنوب آمریکا منشا گرفته است . - 1 -
گیاه تاجخروس از خانوادهیAmarantaceae، دارای 65 - 75 گونه است که40 گونه از آن بومی قاره آمریکا میباشد از این میان 17 گونه بهعنوان سبزی به مصرف میرسند و سه گونه از دانهی آن استفاده میشود و بقیه ازعلفهای هرز مهم است . - 2 - برگ تاجخروس که در آفریقا بهعنوان سبزی مورداستفاده قرار میگیرد کمک شایانی به رژیم غذایی هم ازلحاظ ریزمغذی وهم ترکیبات فعال زیستی میکند.
تاجخروس جزء سبزیهای موردعلاقهی این قاره هست اکثر مردم جهان تاجخروس را بهعنوان گیاه زینتی میشناسند. بیشتر گونههای وحشی نیز بهعنوان منبع غذایی برداشت شدهاند. همانطور که گفته شد معمولاً در آفریقا بهعنوان سبزی از تاجخروس استفاده میکنند ولی در کشورهای آمریکایی بهعنوان غلات مورداستفاده قرار میگیرد و دانهی تاجخروس در آمریکا کشت میشود و اخیراً بهطور جدیتر دانهی تاجخروس در سوپرمارکتها و کارخانههای کنیا، اتیوپی، زیمباوه، اوگاندا استفاده میشود.
ازآنجاکه در سال 1980، تاجخروس بهعنوان یک محصول غذاییعمدتاً مقاوم در برابر حرارت، خشکسالی، بیماریها و آفات معرفی شده است و همینطور ارزش غذایی بالایی هم ازلحاظ دانه وهم برگ، مطالعهی بیماریها و مکانیسمهای ایجاد بیماری در این گیاهعلاوه بر جذابیت فکری و توجیه علمی، یک هدف بسیار کاربردی نیز دنبال میکند و آن یافتن روشهایی برای مبارزه با بیماریهاست. کنترل بیماریها سبب افزایش کمیت و بهبود کیفیت فرآوردههای گیاهی میشود. با توحه به اهمیت و کاربرد فراوان قارچهای اندوفیت، مطالعه حمعیت اندوفیتها در میزبان و شناسایی آنها حائز اهمیت میباشد و میتواند به شناسایی منابع ژنتیکی جدیدی از مقاومت به حشرات، بیماریها و تحمل تنش محیطی کمک نماید.
-2مواد و روشها
1- نمونهبرداری جداسازی و خالصسازی نمونهبرداری از گیاه تاجخروس از مناطق مختلف سه استان تهران، البرز و زنجان - ایجرود، ابهر، سلطانیه، طارم - در فروردین و مهرماه 1395 صورت گرفت بدین ترتیب که از ریشههای سالم حدود صد نمونه جمعآوری شد و در پاکتهای مخصوص که این پاکتها برچسب مربوط به مشخصات گیاه تاجخروس شامل: محل جمعآوری، تاریخ جمعآوری، شخص جمعآوریکننده را به همراه دارند به آزمایشگاه منتقل شد.
بعد از انتقال نمونهها به آزمایشگاه ابتدا با آب شستشو داده و سپس با الکل ضدعفونی شدند در مرحلهی بعد ریشهها را به قطعات کوچک تقسیم و روی محیط کشت عصاره سیبزمینی - دکستروز- آگار - - PDA قرار دادهشدند نمونهها به مدت سه هفته در انکوباتور در دمای 25 2نگهداری شدند و سپس پرگنه-های رشد یافته در اطراف قطعات به روش نوک ریسه خالصسازی گردید بعد از یک هفته قارچها رشد میکنند و به روش نوک ریسه قارچهای جداسازی شده را خالص میکنیم روش نوک ریسه با استفاده از محیط کشت واترآگار میسر میگردد.
2-2 شناسایی مورفولوژیکی و مولکولی
بهمنظور تحریک اسپورزایی، جدایهها به تشتکهای حاوی محیط کشت سیبزمینی -هویج-آگار - PCA - انتقال داده شد و در شرایط نور و تاریکی 12:12 زیر ترکیبی ازنورNUVو فلورسنت در دمای 23 تا 27 درجه سلسیوس به مدت 2-10 هفته نگهداری شدند. در این مدت جدایهها هر چند روز بررسی و بهمحض مشاهدهی اندام خاصی روی پتری، ازآن اسلاید تهیه شد و ازنظر مورفولوژیکی موردبررسی قرار گرفت.
به منظور شناسایی مولکولی جدایهها، ابتدا با استفاده از محیط کشت مایع توده میسلیومی قارچ تهیه شد و سپس با روش صفایی و همکاران - 1384 - دی ان ا. آنها استخراج گردید. بااستفاده از آغازگرهای 5ʼ- - ITS1F - 3 - - CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA -3ʼ و - 4 - - 5ʼ-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ʼ - ITS4 ناحیه ITS1، 5.8S و ITS2 تکثیر شد. . پس از انجام توالی یابی، توالیها در بانک اطلاعات ژنNCBI بلاست گردید. توالیهایپس از انجام توالی یابی، توالیها در بانک اطلاعات ژنNCBI بلاست گردید. توالیهای معتبر گونههای مختلف هر جنس نیز از NCBI گرفته شد..
-3نتایج و بحث
بعد از جداسازی و خالصسازی جدایههای قارچی ابتدا شناسایی مرفولوژیکی صورت گرفت. پرگنه هر دو قارچ درروی محیط کشت PDAبهصورت سفیدرنگ این دو قارچ به سرعت رشد میکنند گونهی Ch. gloeoporiodesدارای اشکال دوایر مانندی است.Ch. iodhpurense در ابتدا دارای میسیلیوم سفید رنگ میباشد اما با گذر زمان کدرتر میشود.
بعد از شناسایی مرفولوژیکی برای تصدیق کار به شناسایی مولکولی میپردازیم.در جدایه های بررسیشده قطعه تقریبا-500 400 جفت بازی مربوط به ناحیهITS1، 5.8Sو ITS2 تکثیر و تعیین توالی شد. پس از بلاست کردن توالیهای نوکلئوتیدی - - Blastn در پایگاه اطلاعاتیNCBI و تایید صحت قطعه توالییابیشده، توالیهای مورد نظر با توالیهای دریافت شده از پایگاه اطلاعاتیNCBI به کمک نرمافزارMega 6.0 و GeneDoc همردیف شدند.
