بخشی از مقاله
چکیده
یکی از پروتئین هاي مهم از خانواده پروتئین هاي کازئین در شیر، پروتئین آلفا - اس -1 کازئین1 می باشد. آنالیز توالی یابی در ناحیه'5 این ژن، آلل هاي متنوعی را در جایگاه هاي اتصال فاکتورهاي موثر بر رونویسی احتمالی آشکار ساخت. این موضوع و همچنین اثر آن روي میزان محتوي پروتئین شیر، ناحیه 5' این ژن را به عنوان یک جایگاه بزرگ اثر بر محتوي پروتئین شیر تایید می کند.
به منظور شناسایی چند شکلی ژن αs1-casein از تعداد 150 راس گوسفند نژاد نائینی خون گیري به عمل آمد. استخراج DNA به روش نمکی بهینه یافته و تکثیر یک قطعه 1100جفت بازي از ناحیه پروموتور و بالادست آن توسط واکنش زنجیرهاي پلی مراز - PCR - با استفاده از یک جفت پرایمر اختصاصی صورت گرفت. تعیین ژنوتیپ هر یک از نمونه ها با استفاده از آنزیم برشی HinfI انجام شد. در پژوهش حاضر براي این ژن در جایگاه مورد مطالعه فقط آلل A شناسایی شد و در نتیجه ژنوتیپ تمامی نمونه ها یک سان - AA - بوده است.
مقدمه
پروتئینهاي شیر در تمام پستانداران به دو گروه عمده شامل کازئینها و پروتئینهاي آب پنیر تقسیم میشوند. از زمانی که براي اولین بار دو واریانت ژنتیکی براي پروتئین بتا لاکتوگلوبولین در شیر گاو شناسایی شد، توجه به این ایده که در سایر پروتئینهاي شیر هم چند شکلی ژنتیکی وجود داشته باشد بالا گرفت. اختلاف ژنتیکی به علت جهش در ژنها میباشد که منجر به جانشینی یک اسید آمینه یا حذف یک یا چند اسید آمینه در پروتئینهاي شیر شود . - 8 -
در تمام گونه هاي پستانداران تنوع بیشتري در کازئین ها نسبت به پروتئین هاي آب پنیر مشاهده شده است. ژن هاي بخش کازئین شیر به چهار گروه عمده کاپا کازئین - با وزن مولکولی 19800 دالتون و 169 اسیدآمینه - ، بتاکازئین - با وزن مولکولی 2400 دالتون و 209 اسیدآمینه - ، آلفا – اس -1 کازئین - با وزن مولکولی 23000 دالتون و 199 اسیدآمینه - و آلفا – اس -2 کازئین - با وزن مولکولی 25000 دالتون و 207 اسیدآمینه - تقسیم می شوند که در گاو، روي کروموزوم شماره 6 و در گوسفند و بز روي کروموزوم شماره 4 قرار گرفته اند.
کاپا کازئین از مهمترین پروتئین هاي شیر است که توسط ژنی با پنج اگزون و چهار اینترون کنترل می شود. مقدار پنیر تولیدي و همچنین ماندگاري شیر در خارج از یخچال به طور مستقیم به خصوصیات کاپاکازئین شیر بر می گردد. با این وجود، در بین تمام کازئین ها، آلفا – اس -1 کازئین داراي بیشترین مقدار یعنی 9 گرم در یک لیتر شیر در مقایسه با سایر پروتئین هاست. لذا از موثرترین پروتئین ها از نظر کمی در شیر می باشد.
ریجنکلس و همکاران - 2002 - در مطالعاتشان به این نتیجه رسیدند که در نشخوارکنندگان، 80 درصد پروتئین هاي شیر را آلفا - اس -1 کازئین، آلفا - اس -2 کازئین، بتا کازئین و کاپا کازئین در بر می گیرند. در بین این کازئین ها آلفا – اس -1 کازئین و آلفا – اس - 2 کازئین و بتا کازئین به کلسیم حساس هستند. وزن مولکولی، نواحی پیش برنده در توالی هاي پپتیدي و موقعیت هاي جایگاه عمده فسفریلاسیون در این پروتئین ها داراي ساختار مشابهی می باشند.
لذا این داده ها از پیدایش فرضیه منشا تکاملی مشترك این ژن ها ازکپی هاي یک ژن اجدادي منحصر به فرد حمایت می کند. ژن هاي پروتئین شیر به وسیله چندین هورمون و فاکتورهاي هسته اي کنترل و تنظیم می شوند . - 5 - لناسی و همکاران - 2005 - نشان دادند که بیان ژنهاي کازئین در شیر یک فرآیند هماهنگی است که در سلولهاي اپیتلیال غده پستانی انجام می گیرد.
غلظت هورمون هاي لاکتوژنیک، پرولاکتین، هیدروکورتیزون و انسولین در اول شیردهی افزایش می یابد. هورمونهاي لاکتوژنیک از طریق انتقال پیام از غشاي سلول به ناحیه پیش برندههاي ژن مسئول پروتئین شیر، فاکتورهاي رونویسی را فعال و از این طریق باعث تغییر در ساختار کروماتین و فعال شدن فرآیند بیان ژن مسئول پروتئین شیر می شوند . - 2 - ناحیه 5' یا پروموتور ژن آلفا - اس -1 کازئین سهم عمده اي در تنظیم بیان ژن پروتئین شیر دارد. فهم بیشتر در مورد فرآیند رونویسی از واریانت هاي ژن آلفا - اس -1 کازئین، فرصت جدیدي براي انتخاب بهترین دام هاي شیرده با تولید پروتئین بالا را مهیا می کند.
پرینزونبرگ و همکاران در سال 2003 پیشنهاد کردند که ناحیه 5' ژن آلفا - اس -1 کازئین می تواند یک نشانگر مفیدي براي افزایش محتوي پروتئین در گله گاوهاي هلشتاین باشد . - 4 - مارتین و همکاران - 2002 - با مطالعه روي کازئین شیر به این نتیجه رسیدند که ژنوتیپ هايCSN1S1 روي محتوي، کازئین، چربی و نسبت کازئین به پروتئین شیر اثر می گذارد. به طوریکه ژنوتیپ AA روي میزان ژله اي شدن شیر براي پنیر سازي در مقایسه با ژنوتیپ هاي EE و FF بهتر و موثرتر عمل می کند .
مواد و روش ها
نمونه برداري و استخراج DNA
در این پژوهش از 150 راس گوسفند نژاد نائینی خون گیري به عمل آمد. جهت استخراج DNA از 5 تا 10 سی سی خون و جهت جلوگیري از انعقاد خون از محلول EDTA به نسبت 1 به 10 استفاده شد. نمونه ها بلافاصله با حفظ شرایط زنجیره سرد به آزمایشگاه ژنتیک مولکولی دانشگاه علوم کشاورزي ساري منتقل و تا زمان استخراج DNA در دماي 4 درجه سانتی گراد نگهداري شدند. جهت استخراج DNA از پروتکل استخراج DNA به روش نمکی بهینه2 یافته و براي تعیین ویژگیهاي کمی و کیفی DNA از الکتروفورز ژل آگارز استفاده شد.
واکنش زنجیره اي پلی مراز - PCR -
در این مطالعه ناحیه پروموتور و بالادست آن از جایگاه ژنی αs1-casein انتخاب و با یک جفت پرایمر اختصاصی قطعه اي به طول 1100 جفت باز تکثیر شد. توالی آغازگر هاي ژن αs1-casein که با استفاده از نرم افزار Oligo5 طراحی شده بود، شامل توالی رفت F: 5′-CAAGGAGTTGCAATCAACAAG -3′ و توالی برگشت R: 5′-GGCCTTGAAATATTCTACCAGA -3′ بود. واکنش زنجیره اي پلی مراز در حجم 25 میکرولیتر شامل 2/5 میکرولیتر بافر PCR - 10x - ، 0/5 میکرولیتر dNTPs، 0/3 میکرولیتر Taq polymerase، 100 نانو گرم DNA ژنومی و 1/7 میکرولیتر Mgcl2 که در نهایت با آب مقطر به حجم 25 میکرولیتر رسیده است، انجام گرفت.
سپس چرخه هاي PCR با برنامه حرارتی شامل: 95 درجه سانتی گراد جهت واسرشت اولیه DNA به مدت 300 ثانیه، واسرشت ثانویه در دماي 95 درجه سانتی گراد به مدت 60 ثانیه، دماي 65 درجه سانتی گراد جهت اتصال پرایمرها به مدت 60 ثانیه، دماي 72 درجه سانتی گراد جهت بسط آغازگرها به مدت 60 ثانیه به تعداد 35 سیکل و بسط نهائی به مدت 600 ثانیه در 72 درجه سانتی گراد انجام شد. جهت تعیین کیفیت محصول PCR از ژل آگارز 1/5 درصد و رنگ آمیزي اتیدیوم بروماید و براي آزمون صحت اندازه قطعه تکثیري ازنشانگر وزنی M100 شرکت فرمنتاز استفاده شد.
تعیین ژنوتیپ
براي تفکیک آللی و تعیین ژنوتیپ هر حیوان از تکنیک PCR-RFLP و الکترفورز ژل آگارز استفاده شد. بعد از هضم آنزیمی نمونهها توسط آنزیم Hinf1 براي مشاهده باند ها از ژل آگارز 2 -1/5 درصد استفاده شد.
نتایج و بحث
بیشتر تحقیقات مرتبط به نشانگرهاي مولکولی که به منظور به نژادي در دام هاي اهلی انجام می گیرد روي آنالیز جهش ها در بین ساختار ژن هایی متمرکز شده اند که بین این جایگاه ها با صفات کمی - QTL - ، پیوستگی وجود داشته و از لحاظ اقتصادي نیز مهم باشند. در این پژوهش با استفاده از یک جفت آغازگر اختصاصی، قطعه مورد نظر از جایگاه ژنی αs1-casein شامل ناحیه پروموتور و بالادست آن به طول 1100 جفت باز تکثیر شد. نمونهاي از محصولات PCR تکثیر شده در شکل 1 آمده است.
شکل -2 نمونه هایی از محصولات PCR ژن αs1-casein به طول 1100جفت باز ، - M نشانگر وزن مولکولی 100 جفت بازي از شرکت سیناژن - اگر در ناحیه پیش برنده جایگاه ژن آلفا - اس -1 کازئین - قطعه 1100 جفت بازي - جایگاه آنزیم HinfI وجود داشته باشد در اثر برش آنزیم دو قطعه 900 و 200 جفت بازي تولید می شود.
اگر این سایت برشی در هر دو آلل این جایگاه وجود داشته باشد سبب بروز ژنوتیپ AA و اگر در یکی یا هیچکدام از آلل ها وجود نداشته باشد به ترتیب سبب بروز ژنوتیپ هاي AB و BB می شود. که همان طور که در شکل 3 نشان داده شده است همه نمونه هاي مورد مطالعه در این جایگاه ژنی آلل وحشی A و در نتیجه ژنوتیپ AA را نشان دادند.
