بخشی از مقاله
چکیده
زنگ قهوهاي یا زنگ برگ یکی از مهمترین بیماريهاي گندم است که تقرباًی در تمام مناطق کشت گندم وجود دارد.مؤثرترین روش کنترل این بیماري استفاده از ارقام مقاوم میباشد. براي تولید ارقام مقاوم، باید ژنهاي مقاومت در منابع ژنتیکی شناسایی شوند. از جمله روشهاي شناسایی این ژنها استفاده از نشانگرهاي مولکولی میباشد. به منظور تعیین حضور یا عدم حضور ژنهاي مقاومت به زنگ قهوهاي Lr26 و Lr35 در 70 ژنوتیپ گندم ایرانی نشانگر SCAR استفاده شد. ابتدا DNA با استفاده از روش SDS استخراج گردید و سپس با آغازگرهاي مربوطه واکنش زنجیرهاي پلیمراز انجام گردید.
بر این اساس حضور ژن مقاومت Lr26 در شاهد مثبت - لاین آیزوژنتیک حاوي ژن - Lr26 و یازده ژنوتیپ دیگر به اثبات رسید. در حالی که در شاهد منفی - تاچر - و 59 ژنوتیپ دیگر مشخص شد که این ژن حضور ندارد. ژن مقاومت Lr35 در شاهد مثبت - لاین آیزوژنتیک حاوي ژن - Lr35 در ناحیه باندي مورد نظر مشاهده شد و در رقم شاهد منفی - تاچر - و دیگر ژنوتیپها مشاهده نگردید.
مقدمه:
بیماريها از جمله عواملی هستند که باعث کاهش محصول گندم شده، و تخمین زده میشود که 13 درصد از کل تولیدات زراعی جهان به وسیله بیماريها از بین میروند . - 13 - از جمله بیماريهاي گندم زنگها هستند که شامل زنگ نواري1، زنگ برگ2 و زنگ ساقه3 میباشند. عامل زنگ قهوهاي Puccinia triticina - syn. P. recondita f. sp. tritici Rob. ex Desm. - در واقع یکی از بیمارگرهاي مخرب گندم میباشد که در تمام مناطق کشت گندم ظاهر شده و میتواند باعث ایجاد بیماري شود . - 8 - این بیماري به عنوان گستردهترین بیماري غلات در سطح دنیا مطرح میباشد - 15 - و اولین بار در سال 1325 از ایران گزارش گردید . - 5 -
استفاده از مقاومت ژنتیکی میزبان به عنوان کاراترین، اقتصاديترین و از لحاظ زیست محیطی سالمترین روش مبارزه با بیماريهاي گیاهی میباشد . - 11 - ارقام مقاوم به بیماري با شناسایی ژنهاي مقاومت در گونه گیاهی یا گونه وحشی خویشاوند و انتقال این ژنها به ارقام و لاینهاي اصلاحی سازگار ایجاد میگردند . - 10 - تاکنون بیش از 60 ژن مقاومت به زنگ برگ بر روي کروموزومهاي گندم شناسایی و مکانیابی شدهاند . - 12 - به تازگی ژن Lr53 بر روي بازوي کوتاه کروموزوم 6B گندم نقشهیابی شد . - 4 -
قبل از کشف و شناسایی نشانگرهاي مولکولی، جهت شناسایی ژنهاي مقاومت از آزمایش استنتاج ژنی1 استفاده میشد. بدین ترتیب که گیاهچه مربوط به ژرمپلاسمهاي مختلف را با تیپهاي بیماريزا و غیربیماريزا2 قارچ تلقیح کرده و از طریق مقایسه واکنش ژنوتیپها و ارقام استاندارد به گروهی از نژادهاي زنگ، ژن هاي مقاومت شناسایی میشدند. اما این روش داراي محدودیتهایی میباشد از جمله این که ژنهاي مؤثر در مرحله گیاه کامل مانند ژن Lr35 در مرحله گیاهچهاي قابل شناسایی نیستند و وجود و عدم وجود بیماريزایی براي آنها در شرایط گلخانه به سادگی قابل تشخیص نمیباشد.
همچنین شناسایی همه ژنها با استفاده از نژادهاي فیزیولوژیک موجود امکانپذیر نمیباشد و علاوه بر این، در صورت وجود دو ژن مقاومت به زنگ در گیاه، اگر ژن اول تیپ آلودگی3 پایینتر نسبت به ژن دوم ایجاد کند، ژن دوم دیگر به وسیله این روش قابل شناسایی نیست و تنها از طریق شناسایی ژن دیگري که با این ژن در گیاه پیوستگی داشته باشد قابل تشخیص میباشد. روشهاي مولکولی راه حلهاي جامعی براي تشخیص و شناسایی ژنوتیپها ارائه داده است.
نشانگرهاي مولکولی DNA ابزاري مفید براي شناسایی ژنها و انتخاب گیاهان با ژنهاي مشخص در جمعیتهاي در حال تفرق میباشد و باعث تسریع شناسایی ژنهاي مقاومت به زنگ قهوهاي میشوند. همچنین باعث شناسایی ژنهاي مفید در غیاب تیپهاي بیماريزا در جمعیت عامل بیماري براي آن ژن میشود. نشانگرهاي مختلفی براي ژنهاي مقاومت به زنگ قهوه اي گزارش شدهاند از جمله نشانگر ریزماهواره براي Lr53 اخیرا گزارش گردید . - 4 -
علیرغم کاربرد وسیع نشانگرها، نشانگرهاي ملکولی در شناسایی ژنهاي مقاومت به زنگ در ژنوتیپهاي ایرانی زیاد مورد استفاده قرار نگرفتهاند. لذا در این تحقیق از دو نوع نشانگر مولکولی 4SCAR براي تأیید حضور یا عدم حضور ژنهاي مقاومت به زنگ قهوهاي در ارقام مختلف گندم با زمینه هاي مختلف ژنتیکی استفاده شده است.
مواد و روشها:
در این تحقیق هفتاد ژنوتیپ گندم شامل 52 رقم اصلاح شده و 18 ژنوتیپ محلی استفاده شد. دي. ان. اي ژنومی از برگ گیاهچههاي 10 روزه که در گلخانه تحقیقاتی دانشگاه شیراز کشت شده بودند به روش SDS استخراج گردید . - 3 - علاوه بر این، دي. ان. اي از ژنوتیپهاي شاهد - آیزوژنیک لاین5 هر ژن مقاومت به زنگ قهوهاي به عنوان شاهد مثبت NIL - حاوي آن ژن که از گندم حساس تاچر6 تهیه شده - و شاهد منفی - تاچر - - نیز استخراج شد.
کیفیت و کمیت دي. ان. اي با استفاده از نانودراپ و الکتروفورز بر روي ژل آگارز - یک درصد - مشخص گردید. سپس نمونههایی که داراي کیفیت بالایی بودند انتخاب و محلول کاري با غلظت 100 نانوگرم در میکرولیتر تهیه و مورد استفاده قرار گرفت. آغازگر اختصاصی SCAR با نام - 9 - iag95 براي ردیابی ژن مقاومت Lr26 مورد استفاده قرار گرفت.
این آغازگر قادر به تکثیر قطعهاي 1100 جفت بازي در رقم شاهد مثبت و ارقام داراي این ژن میباشد اما در رقم شاهد منفی و ارقام فاقد این ژن تکثیري مشاهده نمیشود و از طریق تکثیر این قطعه باندي بین ژنوتیپهاي مختلف چند شکلی نشان میدهد. براي ژن مقاومت به زنگ قهوهاي Lr35 ، آغازگر اختصاصی SCAR با نام - 6 - Sr39 استفاده شد. این آغازگر قادر به تکثیر قطعهاي 900 جفت بازي در گیاهان مقاوم میباشد ولی هیچ تکثیري در گیاهان حساس صورت نمیگیرد. آغازگرهاي مورد استفاده در این تحقیق از شرکت متابیون تهیه شده، مورد استفاده قرار گرفت.
واکنش زنجیرهاي پلیمراز و شرایط الکتروفورز: حجم کلی لولههاي واکنش 20 میکرولیتر شامل DNA ژنومی گندم با غلظت 50 نانوگرم، بافر 10X با غلظت 1X، کلرید منیزیم با غلظت 1/5 میلی مول، dNTP با غلظت 0/2 میلی مول، 10 پیکومول از هر آغازگر، 0/2 میکرولیتر Taq پلیمراز 5 واحد در میکرولیتر، آب دو بار سترون بود.
جهت تکثیر باند مربوطه، مخلوط واکنش بعد از تهیه به دستگاه ترموسایکلر BIOER انتقال داده شد - شرایط تکثیر باندها در جدول زیر نشان داده شده است - . فراورده هاي واکنش زنجیرهاي پلیمراز بر روي ژل آگارز یک درصد از هم جدا شدند که براي انجام الکتروفورز از ولتاژ 80 ولت به مدت 2 ساعت استفاده گردید. رنگ آمیزي با اتیدیوم بروماید و عکس برداري با دستگاه ژل داك Gene Flash صورت گرفت.
نتایج و بحث:
آنالیز نتایج حاصل از آغازگر :SCAR - iag95 -
این نشانگر با تکثیر قطعه باندي 1100 جفت بازي حضور ژن مقاومت Lr26 را مشخص میکند - شکل . - 1 بعد از انجام واکنش زنجیرهاي پلیمراز و الکتروفورز محصولات مشخص شد که ژن مقاومت Lr26 در شاهد مثبت و 11 ژنوتیپ مورد مطالعه در این تحقیق وجود دارد که عبارتند از ژنوتیپهاي محلی 2، 4، 7، 23، 24، 25، 26 و ارقام اصلاح شده آرتا، شیرودي، پیشتاز و فلات. در رقم شاهد منفی و 59 رقم باقی مانده از ارقام مورد مطالعه به دلیل عدم تکثیر قطعه باندي مورد نظر، ژن مقاومت Lr26 وجود ندارد.
آنالیز نتایج حاصل از آغازگر :SCAR - Sr39 -
انجام واکنش زنجیرهاي پلیمراز بر روي ارقام مورد مطالعه در این تحقیق موجب تکثیر قطعهاي 900 جفت بازي در شاهد مثبت NIL - حاوي ژن مقاومت - Lr35 شد ولی در شاهد منفی - تاچر - و ارقام مورد مطالعه در این ناحیه، باندي مشاهده نگردید. این نتیجه نشان از عدم حضور ژن مقاومت Lr35 در ارقام مورد بررسی میباشد.
