بخشی از مقاله
چکیده
قارچهای میکوریز بعنوان یکی از مهمترین ترکیبات ریزوسفر گیاه، نقشهای کلیدی در اکوسیستم و وظایف گیاه دارند. این قارچها با طیف وسیعی از گیاهان از جمله پسته تحت شرایط مختلف همزیستی برقرار میکنند. یکی از مهمترین نقش آنها کمک به گیاهان میزبان در جذب عناصر غذایی - بخصوص فسفر - است. در این تحقیق 8 نمونه قارچ میکوریز بومی جدا شده از درختان پسته باغاهای رفسنجان و گیاهان غیر زراعی با گیاه اندروپگون تلقیح و گیاهان در دو نوبت 7 و 11 هفته برداشت شدند. شناسایی و تنوع جنس قارچ های میکوریز در ریشه گیاهان اندروپگون - Andropogon - gerardii با روش NGS انجام شد. نتایج نشان داد قارچ Funneliformis در تمام نمونههای جدا شده از باغات پسته به مقدار فراوان وجود دارد. در نمونههای جدا شده از گیاهان غیر زراعی در نمونه های Funneliformisوجود داشت.
گونه معمول در گیاهان غیر زراعیRhizophagus بود. قارچ Claroideoglomus در نمونه 42 باغات پسته نیز وجود داشت. در نمونههای 51 و 25 باغات پسته قارچ Rhizophagusirregularis وجود داشت اما این قارچ در دو نمونه دیگر به مقدار کمی وجود داشت. همچنین وجود مقدار زیادی قارچ unidentifiedGlomerales در نمونه باغات پسته2 مشخص شد. نتایج بطور کلی نشان میدهد قارچFunneliformis وRhizophagus فراوانترین گونههای قارچ در نمونههای مورد مطالعه بودند. همچنین اسپورهای شبیه قارچ Claroideoglomus در نمونهها وجود داشت که ممکن است به سایر گونهها تعلق داشته باشد یا اینکه کارایی این روش برای شناسایی این گونه قارچ پایین بوده است. ضمنا با گذشت زمان در هفته یازدهم در نمونه های باغهای پسته، مقدار Funneliformisکاهش یافت.
کلمات کلیدی:قارچ میکوریز بومی، پسته، .NGS
مقدمه
ارتباط همزیستی بین گیاهان و قارچ میکوریز به عنوان آربسکولار میکوریز شناخته میشود. در این رابطه همزیستی قارچمیکوریز مبادله عناصرمعدنی را با کربن گیاه انجام میدهد و اثر قابل توجهی بر روی تولید گیاه دارد. گیاه برای حمایت اینقارچ درسلولهای کورتیکال خود تغییرات قابل توجهی شامل ایجاد غشای جدید در فضای آپوپلاستی جایی که قارچ میکوریز سکونت دارد، را بوجود میآورد. این سطح مشترک محل تبادل عناصر غذایی بین گیاه و قارچ است و نقش کلیدی برای این همزیستی دارد . - Smith & Read, 2008 - قارچهای میکوریزسابقاً توسط خصوصیات مورفولوژیک اسپور شناسایی میشدند و در صورت نبود اسپور استفاده از اندامهای داخلی بهترین روش برای شناسایی آنها بود.
اما چون برخی از جدایه-های قارچ میکوریز در داخل ریشه با استفاده از رنگ امیزی دیده نشدند و یا با استفاده از رنگهای استاندارد اثرات ضعیفی از آنهایافت میشد، قابل شناسایی نبودند. قدرت تولید اسپور به حد قابل توجهی وابسته به خصوصیات فیزیولوژیک قارچمیکوریز و شرایط محیطی است. قارچ میکوریز ممکن است در تحت یک شرایط یا در طول یک فصل تعداد زیادی اسپور تولید کند و به عنوان قارچ غالب در کلنیزاسیون ریشه به حساب آورده شود و در شرایط متفاوت چنین وضعیتی را ممکن است نداشته باشند. از طرف دیگر قدرت تولید اسپور و قدرت کلنیزه کردن گیاهان در قارچهای مختلف متفاوت است. - Kruger, Stockinger , Kruger , & Schussler, 2009 -
چنین گزارشاتی در رابطه با قارچ های اکتومیکوریز نیز بیان شده است. Gardes - 1996 - وBruns نشان دادند قارچ اکتو میکوریزSuillus pungens تنها 4 درصد از ریشه را اشغال کرده است درصورتی که براساس اندامهای خارجی قارچ غالب ریشه در کلنیزاسیون است. با توجه به اهمیت قارچهای میکوریز درکشاورزی پایدار، این پژوهش با هدف بررسی تنوع و شناسایی قارچهای میکوریز بومی جدا شده از باغهای پسته و مقایسه آنها با میکوریز جدا شده از گیاهان غیر زراعی بود.
مواد و روشها
منطقه مورد مطالعه شامل باغهای پسته شهرستانهای رفسنجان، زرند و کرمان در استان کرمان بود که در موقعیتجغرافیایی با طول 67.6439E و عرض 29.4850N قرار داشت. میزان بارندگی سالیانه بطور متوسط حدود 100 میلیمتر و میزان تبخیر و تعرق آن حدود 3000 میلیمتر است. گیاهان مورد بررسی شامل درخت پسته اهلی - Pistacia Vera L - متعلق به تیره سماق - Anacardiaceae - بود. جنس Pistacia دارای 11 گونه است و گیاهان این تیره بصورت درخت یا درختچه هستند. نمونههای قارچ میکوریز از ریزوسفر 56 درخت پسته از مناطق مختلف کرمان، زرند و رفسنجان جمع آوری شدند،برای جمع آوری خاک و ریشه درختان پسته یک درخت در وسط باغ پسته انتخاب و سه گودال به عمق 80 سانتی متر در اطراف درخت حفر شد و خاک دو قسمت 0تا 40 و 40 تا 80 سانتی متر جمع آوری شد.
خاکهای هر عمق باهم مخلوط و حدود 5 کیلوگرم از هر عمق خاک به آزمایشگاه منتقل شد. برای جمع آوری ریشه، ابتدا خاک اطراف بخشی ازریشه اصلی تخلیه و ریشههای مویین از آن جدا و به همراه خاک اطراف به عنوان مایه تلقیح به آزمایشگاه منتقل و تا زمان کشت وآزمایشات بعدی، در یخچال نگهداری شد. برخی از اطلاعات نظیر مقدار آب مصرفی و دور آبیاری قطعه مورد نظر ثبت و درنمونه خاکهای جمع آوری شده EC در عصاره1 به 5 قرائت شد. برای رنگآمیزی ریشه بر اساس روش Phillips andHayman - 1970 - استفاده شد. و 4 نمونه از گیاهان غیر زراعی شامل Alhagi،eucalyptus، Tamarix،carthamus tinctoriusبود.
بر اساس نتایج میزان شوری، تنش خشکی و درصد کلنیزاسیون، 17 نمونه انتخاب و با گیاه سورگوم کشت شدند. درنهایت با توجه به خصوصیات رشدی سورگوم و درصد کلنیزاسیون ریشه، 4 نمونه برتر برای شناسایی انتخاب شد. 4 نمونه انتخاب شده با گیاه اندروپگون تلقیح و در دو مرحله 7 و 11 هفته پس از کشت برداشت شد. ریشهها با آب مقطر بخوبیشسته شد ودر فریزر در دمای-20 قرار داده شد. برای استخراج DNA مقدار 300 میلیگرم ریشه تازه در هاون چینی اتوکلاو شده قرار داده شد.500 میکرولیتر از محلول استخراج از کیت NucleoSpin® Plant ساخت شرکت Macherey-Nagel آلمان بر روی آن ریخته و به خوبی هموژنیزه شد و به لولههای استخراج DNA کیت انتقال داده شد.
مطابق با دستور کار شرکت مربوطه، کار استخراج DNA انجام گرفت. پس از استخراج مقدار کیفیتDNA با اسپکتوفتومتر نانوداراپ اندازهگیری شد. نمونهها در فریزر در دمای-20 نگهداری شد.برای روش NGS از روش PCR آشیانهای استفاده شد. پرایمرهای مرحله اول مطابق با پرایمرهای اختصاصی میکوریز - Kruger, Stockinger, Kruger, & Schussler, 2009 - و مرحله دوم PCR با استفاده از پرایمرهای 4-ITS و َ؟ِS×انجام شد.دادهها با استفاده از نرم افزار Seed آنالیز و نمودارها با Sigma Plot رسم شد.
نتایج و بحث
در این آزمایش قارچهای میکوریز با گیاهان اندروپگون - Andropogon gerardii - تلقیح و در دو مرحله زمانی 7 و 11هفته بعد از کشت، برداشت و شناسایی ملکولی با پرایمرهای اختصاصی میکوریز و پرایمرهای عمومی - شکل - 1 انجام شد.نتایج شناسایی قارچ میکوریز در ریشه گیاه اندروپگون نشان داد قارچ Funneliformis در تمام نمونههای جدا شده از باغات پسته به مقدار فراوان و در نمونههای جدا شده از گیاهان غیر زراعی Carthamus وEucalyptus نیز وجود داشت. گونه معمول در گیاهان غیر زراعیRhizophagus بود.
قارچ Claroideoglomus در نمونه 42 باغات پسته، Carthamus و Alhagi جود داشت. در نمونههای 51 و 25 قارچ Rhizophagusirregularis وجود داشت اما این قارچ در دو نمونه دیگر پسته به مقدارکمی وجود داشت. همچنین وجود مقدار زیادی قارچ unidentifiedGlomerales در نمونه 2 مشخص شد. نتایج بطور کلی نشان میدهد قارچFunneliformis وRhizophagus فراوانترین گونههای قارچ در نمونه 25 بودند. همچنین اسپورهای شبیه قارچ Claroideoglomus در نمونهها وجود داشت که ممکن است به سایر گونهها تعلق داشته باشد یا اینکه کارایی این روش
